III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.1. Ly trích hoạt chất ARL trong hạt neem
Hoạt chất ARL trong hạt neem được ly trích theo sơ đồ 2.1, sau đây là một số kết quả thu nhận được.
3.1.1.1. Tách vỏ hạt neem và nghiền nhỏ nhận hạt
Hạt neem có lớp vỏ cứng bên ngoài chiếm khoảng 50 – 55% trọng lượng hạt, nhân hạt chiếm khoảng 44 – 45%. Trước khi ép hạt neem người ta thường tách vỏ hạt vì nếu ép nguyên vỏ, dầu neem thu được có màu sẫm và chứa nhiều mảnh vỏ hạt. Ngoài ra vỏ hạt neem có chứa khoảng 0,2% hoạt chất limonoid nên cần được tận dụng để điều chế phân bón hoặc các chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật.
Dùng máy tách vỏ hạt neem (Hình 3.1) để tách vỏ 20kg hạt neem thu được 8,8 kg nhân hạt, sau đó nghiền nhỏ nhân hạt đến cỡ hạt 0,5-1mm để chuyển qua máy ép thủy lực để ép dầu. 3.1.1.2. Ép dầu neem : : 500mm. : 706 cm2 ứ . :150kg/cm2 .
Chức năng hoạt động của máy ép:
Máy có thể ép piston xuống sát mặt đáy có lỗ thoát.
Chất lỏng được thoát ra ngoài qua hệ thống lỗ “tàn ong” với 1 tấm lưới 40 và một tấm lưới 80.
Sau khi ép xong, piston được nâng lên cách mặt trên của xi lanh một khoảng 300 mm.
Bên dưới “tàn ong” có hệ thống đẩy nguyên liệu lên miệng xi lanh để tách lấy bánh neem ra.
30
Sau đó “tàn ong” được hạ xuống trở về vị trí ban đầu. Quá trình hoạt động được lặp lại.
Tất cả các bộ phận của máy có tiếp xúc với nguyên liệu đều làm bằng thép không rỉ.
Công suất máy ép: 20kg hạt neem/giờ (Hình 3.2).
Dầu neem được đưa qua máy lọc ép để tách các tạp chất cơ học, sau đó cho vào dầu khoảng 1-2% chất hút ẩm Na2SO4 khan để hút nước có trong dầu.
Phần bánh neem còn lại khoảng 7,3 kg (83% trọng lượng nhân hạt) được dùng để trích ly ARL. Bánh neem phải được đập cho nát nhỏ ra và sử dụng ngay không để quá 24giờ.
3.1.1.3. Chiết suất ARL trong bánh neem
Chiết xuất hoạt chất ARL trong bánh dầu neem trong 24 giờ, lần lượt với các dung môi có độ phân cực khác nhau như hexane, ether dầu, ethyl acetate, ethanol, dichloromethane(5 dung môi) trong bình Soxhlet (Hình 3.3).
Lọc ly tâm thu nước cái và loại bỏ bã để chuyển sang xử lý làm phân bón.
3.1.1.4. Thu các loại cao ARL
Chưng cất dưới áp suất thấp trong máy cô quay để tách dung môi và thu các cao trích ly (TL) với các dung môi có độ phân cực khác nhau: Cao TL C6H14, cao TL ether dầu, cao TL EtOAC, cao TL EtOH, cao CH2Cl2 (Hình 3.4).
3.1.1.5. Tách các ARL khác nhau trong mỗi loại cao TL
Chạy sắc ký bản mỏng mỗi loại cao TL với các dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần. Sử dụng các bản sắc ký điều chế silica gel tráng sẵn loại silica gel preparative Merck Kielselgel 60, F254, 500μm để tách các ARL trong mỗi loại cao.
Dùng các thuốc thử biệt tính có tác dụng hiện màu các nhóm chức khác nhau trong hạt neem trên sắc ký đồ để từ đó phát hiện các ARL có trong 5 loại cao TL.
Bảng 3.1: Thuốc thử biệt tính để xác định các nhóm chứa hóa học.
TT Nhóm chức Thuốc thử Kết quả màu xuất hiện
1 Sterol Liebermann-Burchard Màu đỏ - hồng 2 Limonoid,
Triterpenoid
Salkowski Màu xanh – lục 3 Flavonoid,
Benzopyron
31 4 Alcaloid, Hợp chất amin Bouchardat Mayer Trầm hiện nâu. Trầm hiện vàng nâu 5 Đường khử Hợp chất aldehyd Fehling Trầm hiện đỏ 6 Tanin Arylphenol Gelatin mặn
Dd FeCl3 1% trong nước
Màu vàng nhạt để lâu hóa nâu Dd chuyển màu xanh
7 Chất béo Thấm vào giấy lọc Vết dầu loang trên giấy lọc Kết quả được ghi trong bảng 3.2
Bảng 3.2: Kết quả xác định thành phần hóa học cơ bản của 5 loại cao TL.
TT Thuốc thử/Hoạt chất Cao TL hexane Cao TL ether dầu Cao TL EtOAc Cao TL EtOH Cao TL CH2Cl2 1 Liebermann- Burchar/Sterol - + + +++ ++ 2 Salkowski/Limonoid, Triterpenoid + - + ++ ++ 3 Shibata/Flavonoid, Benzopyron - - - ++ + 4 Bouchardat/Alcaloid, HC amin - - - - - 5 Mayer/Alcaloid, HC amin - - - - - 6 Fehling/Đường khử, HC aldehyde - - - - - 7 Gelatin mặn/Tanin, Arylphenol - + + + + 8 Dd FeCl3 1%/Tanin, Arylphenol - + + + + 9 Giấy lọc/chất béo +++ + + - -
Dấu – : không hiện màu
Dấu + : có hiện màu của nhóm chức hóa học tương ứng.
Thuốc thử Salkowski làm cho các limonoid hiện ra có màu xanh lục. Kết quả cho thấy có 6 limonoid:
1 limonoid ARL1 trong cao TL hexane 1 limonoid ARL2 trong cao TL ethyl acetate
32
2 limonoid ARL3, ARL4 trong cao TL ethanol
2 limonoid ARL5, ARL6 trong cao TL dichloromethan Gọi tên chung 6 limonoid này là ARLx.
Hình 3.1: Máy tách vỏ hạt neem.
33
Hình 3.3 : Trích hoạt chất ARL trong bánh neem trong hình Soxhlet
34
3.1.1.6. Tách các limonoid ARLx
Hòa tan 6 limonoid hiện ra trên sắc ký đồ ARL1, ARL2, ARL3, ARL4, ARL5, ARL6 trong các dung môi tương ứng, lọc bỏ tạp chất, chưng cất dưới áp suất thấp thu hồi dung môi; 6 limonoid đã được tách riêng ra ARL1, ARL2, ARL3, ARL4, ARL5, ARL6 có dạng đậm đặc. Hòa tan các limonoid ARLx trong nước cất thành 6 dung dịch ARLx 1%. Thử nghiệm tính sát khuẩn của 6 ARLx này đối với 2 chủngNitrosomonas sp và Nitrobacter sp.
3.1.2. Phân lập và nhân giống 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp 3.1.2.1. Phân lập và nhân giống chủng Nitrosomonas sp