II. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.4.1. Thay đổi tỷ lệ trộn Limo NI và urê
Phối trộn Limo NI và urê theo các tỷ lệ khác nhau (%): 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 (6 nghiệm thức). Thực hiện thử nghiệm theo mô hình trong nội dung 3 với 6 nghiệm thức này.
2.4.2. Đo hàm lƣợng nitrat đối với mỗi nghiệm thức
Thực hiện cách đo hàm lượng nitrat dựa theo đường chuẩn trong nội dung 3. Xác định tỷ lệ Limo NI/urê làm giảm thấp nhất lượng nitrat thất thoát.
2.5. NỘI DUNG 5: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NHIỆM ĐO LƢỢNG NITRAT ĐƢỢC CÂY TRỒNG HẤP THU – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ ĐO LƢỢNG NITRAT ĐƢỢC CÂY TRỒNG HẤP THU.
2.5.1. Mô hình thử nghiệm
Chế phẩm Limo NI có tác dụng khử các vi sinh vật nitrit hóa phân đạm trong đất sinh ra nitrat NO3–, một phần ngấm dần theo nước vào đất làm ô nhiễm nguồn nước ngầm, một phần được cây trồng hấp thu làm ô nhiễm nguồn thực phẩm.
Dùng chế phẩm Limo NI bao phân đạm urê theo các tỷ lệ khác nhau và bón phân urê có bao Limo NI cho cây cải ngọt và cây dưa chuột. Đo hàm lượng nitrat do các cây này hấp thu để đánh giá tác dụng khử các vi sinh vật nitrit hóa của chế phẩm Limo NI.
Thử nghiệm được thực hiện trên 2 luống rau, mỗi luống có diện tích 70m2 và đươc chia làm 7 ô, mỗi ô có diện tích 10m2 đánh số từ số 1 đến số 7.
Thay đổi tỷ lệ bao Limo NI/urê (%) : 0 (đối chứng), 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 (7 nghiệm thức) để bón cho 7 ô trồng cải ngọt và dưa chuột.
2.5.2. Phƣơng pháp thử nghiệm
2.5.2.1. Lƣợng phân bón và phƣơng cách bón
a. Cây cải ngọt
Bón lót: Bón 100% lượng phân hữu cơ sinh học + 30% urê bao Limo NI + 100% superphosphat + 50% sulfat kali.
Bón thúc đợt 1: Khi hồi xanh (sau khi trồng 7 ngày) bón 40% urê bao + 30% sulfat kali.
27
b. Cây dưa chuột
Bón lót: Bón 100% lượng phân hữu cơ + 30% urê bao Limo NI + 100% superphosphat + 20% sulfat kali.
Bón thúc đợt 1: Khi cây có 2-3 lá thật, bón 50% urê bao Limo NI + 30% sulfat kali. Bón thúc đợt 2: Sau khi cây có hoa đến khi bắt đầu thu quả, bón 20% urê bao Limo NI + 50% sulfat kali.
2.5.2.2. Chăm sóc và thu hoạch
Trong thời gian khảo nghiệm, các khâu chăm sóc như phòng trừ sâu bệnh, bón phân, tưới nước…, được thực hiện như nhau ở tất cả các nghiệm thức.
Thu hoạch:
Khi thu hoạch cây cải ngọt, cắt toàn bộ cây, làm sạch, tỉa bỏ lá vàng úa, rũ sạch bụi bẩn; sau đó đo hàm lượng nitrat trong cây cải ngọt.
Thu hoạch dưa chuột khi các u ở quả còn nổi rõ tức là sau khi hoa cái tàn, vỏ trái có màu xanh mượt còn lớp phấn trắng; sau đó đo hàm lượng nitrat trong trái dưa chuột.
2.6. NỘI DUNG 6: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NHIỆM XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG LÀM TĂNG NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG CỦA LIMO NI – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LÀM TĂNG NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG CỦA LIMO NI – NGHIÊN CỨU CÁC TỶ LỆ PHỐI TRỘN LIMO NI VỚI URÊ VÀ XÁC ĐỊNH NĂNG SUẤT CÂY TRỒNG DƢA CHUỘT, CẢI NGỌT).
2.6.1. Mô hình thử nghiệm
Phân đạm là một loại phân rất quan trọng trong nông nghiệp được nông dân sử dụng rộng rãi để bón cho cây trồng. Tuy nhiên phân đạm ngay sau khi bón vào đất bị các vi sinh vật trong đất phân giải làm thất thoát một lượng lớn đạm trong phân. Chỉ có một phần nhỏ đạm NH3 được cây trồng hấp thu còn phần lớn NH3 bị thất thoát do bốc hơi vào không khí và bị nitrit hóa thành nitrit NO2 và nitrat NO3–.
Dùng chế phẩm Limo NI bao phân đạm urê theo các tỷ lệ khác nhau và bón phân urê có bao Limo NI cho cây cải ngọt và cây dưa chuột. Đo năng suất cây cải ngọt và dưa chuột để đánh giá tác dụng của Limo NI đến năng suất cây trồng.
Thử nghiệm được thực hiện trên 2 luống rau, mỗi luống có diện tích 70m2, luống 1 trồng cải ngọt, luống 2 trồng dưa chuột; mỗi luống chia làm 7 ô, mỗi ô có diện tích 10m2 đánh số từ số 1 đến số 7.
Thay đổi tỷ lệ bao Limo NI/urê (%) : 0 (đối chứng), 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 (7 nghiệm thức) để bón cho 7 ô trồng cải ngọt và dưa chuột.
28
2.6.2. Phƣơng pháp thử nghiệm
2.6.2.1. Lƣợng phân bón và phƣơng cách bón
a.Cây cải ngọt
Bón lót: Bón 100% lượng phân hữu cơ NT + 30% urê bao Limo NI + 100% superphosphat + 50% sulfat kali.
Bón thúc đợt 1: Khi hồi xanh (sau khi trồng 7 ngày) bón 40% urê bao + 30% sulfat kali.
Bón thúc đợt 2: Sau khi trồng 15 ngày, dùng hết lượng urê bao và sulfat kali còn lại.
b. Cây dưa chuột
Bón lót: Bón 100% lượng phân hữu cơ ĐCX + 30% urê bao Limo NI + 100% superphosphat + 20% sulfat kali.
Bón thúc đợt 1: Khi cây có 2-3 lá thật, bón 50% urê bao Limo NI + 30% sulfat kali. Bón thúc đợt 2: Sau khi cây có hoa đến khi bắt đầu thu quả, bón 20% urê bao Limo NI + 50% sulfat kali.
2.6.2.2. Chăm sóc và thu hoạch
Trong thời gian khảo nghiệm, các khâu chăm sóc như phòng trừ sâu bệnh, bón phân, tưới nước…, được thực hiện như nhau ở tất cả các nghiệm thức.
Thu hoạch:
Khi thu hoạch cây cải ngọt, cắt toàn bộ cây, làm sạch, tỉa bỏ lá vàng úa, rũ sạch bụi bẩn, sau đó cân trọng lượng để xác định năng suất sản phẩm của 7 ô trồng khảo nghiệm cây cải ngọt.
Thu hoạch dưa chuột khi các u ở quả còn nổi rõ tức là sau khi hoa cái tàn, vỏ trái có màu xanh mượt còn lớp phấn trắng. Sau đó cân trọng lượng dưa chuột thu hoạch trên mỗi ô để xác định năng suất sản phẩm của 7 ô trồng dưa chuột.
29
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU LY TRÍCH HOẠT CHẤT ARL TRONG HẠT NEEM AZADIRACHTA INDICA NEEM AZADIRACHTA INDICA
3.1.1. Ly trích hoạt chất ARL trong hạt neem
Hoạt chất ARL trong hạt neem được ly trích theo sơ đồ 2.1, sau đây là một số kết quả thu nhận được.
3.1.1.1. Tách vỏ hạt neem và nghiền nhỏ nhận hạt
Hạt neem có lớp vỏ cứng bên ngoài chiếm khoảng 50 – 55% trọng lượng hạt, nhân hạt chiếm khoảng 44 – 45%. Trước khi ép hạt neem người ta thường tách vỏ hạt vì nếu ép nguyên vỏ, dầu neem thu được có màu sẫm và chứa nhiều mảnh vỏ hạt. Ngoài ra vỏ hạt neem có chứa khoảng 0,2% hoạt chất limonoid nên cần được tận dụng để điều chế phân bón hoặc các chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật.
Dùng máy tách vỏ hạt neem (Hình 3.1) để tách vỏ 20kg hạt neem thu được 8,8 kg nhân hạt, sau đó nghiền nhỏ nhân hạt đến cỡ hạt 0,5-1mm để chuyển qua máy ép thủy lực để ép dầu. 3.1.1.2. Ép dầu neem : : 500mm. : 706 cm2 ứ . :150kg/cm2 .
Chức năng hoạt động của máy ép:
Máy có thể ép piston xuống sát mặt đáy có lỗ thoát.
Chất lỏng được thoát ra ngoài qua hệ thống lỗ “tàn ong” với 1 tấm lưới 40 và một tấm lưới 80.
Sau khi ép xong, piston được nâng lên cách mặt trên của xi lanh một khoảng 300 mm.
Bên dưới “tàn ong” có hệ thống đẩy nguyên liệu lên miệng xi lanh để tách lấy bánh neem ra.
30
Sau đó “tàn ong” được hạ xuống trở về vị trí ban đầu. Quá trình hoạt động được lặp lại.
Tất cả các bộ phận của máy có tiếp xúc với nguyên liệu đều làm bằng thép không rỉ.
Công suất máy ép: 20kg hạt neem/giờ (Hình 3.2).
Dầu neem được đưa qua máy lọc ép để tách các tạp chất cơ học, sau đó cho vào dầu khoảng 1-2% chất hút ẩm Na2SO4 khan để hút nước có trong dầu.
Phần bánh neem còn lại khoảng 7,3 kg (83% trọng lượng nhân hạt) được dùng để trích ly ARL. Bánh neem phải được đập cho nát nhỏ ra và sử dụng ngay không để quá 24giờ.
3.1.1.3. Chiết suất ARL trong bánh neem
Chiết xuất hoạt chất ARL trong bánh dầu neem trong 24 giờ, lần lượt với các dung môi có độ phân cực khác nhau như hexane, ether dầu, ethyl acetate, ethanol, dichloromethane(5 dung môi) trong bình Soxhlet (Hình 3.3).
Lọc ly tâm thu nước cái và loại bỏ bã để chuyển sang xử lý làm phân bón.
3.1.1.4. Thu các loại cao ARL
Chưng cất dưới áp suất thấp trong máy cô quay để tách dung môi và thu các cao trích ly (TL) với các dung môi có độ phân cực khác nhau: Cao TL C6H14, cao TL ether dầu, cao TL EtOAC, cao TL EtOH, cao CH2Cl2 (Hình 3.4).
3.1.1.5. Tách các ARL khác nhau trong mỗi loại cao TL
Chạy sắc ký bản mỏng mỗi loại cao TL với các dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần. Sử dụng các bản sắc ký điều chế silica gel tráng sẵn loại silica gel preparative Merck Kielselgel 60, F254, 500μm để tách các ARL trong mỗi loại cao.
Dùng các thuốc thử biệt tính có tác dụng hiện màu các nhóm chức khác nhau trong hạt neem trên sắc ký đồ để từ đó phát hiện các ARL có trong 5 loại cao TL.
Bảng 3.1: Thuốc thử biệt tính để xác định các nhóm chứa hóa học.
TT Nhóm chức Thuốc thử Kết quả màu xuất hiện
1 Sterol Liebermann-Burchard Màu đỏ - hồng 2 Limonoid,
Triterpenoid
Salkowski Màu xanh – lục 3 Flavonoid,
Benzopyron
31 4 Alcaloid, Hợp chất amin Bouchardat Mayer Trầm hiện nâu. Trầm hiện vàng nâu 5 Đường khử Hợp chất aldehyd Fehling Trầm hiện đỏ 6 Tanin Arylphenol Gelatin mặn
Dd FeCl3 1% trong nước
Màu vàng nhạt để lâu hóa nâu Dd chuyển màu xanh
7 Chất béo Thấm vào giấy lọc Vết dầu loang trên giấy lọc Kết quả được ghi trong bảng 3.2
Bảng 3.2: Kết quả xác định thành phần hóa học cơ bản của 5 loại cao TL.
TT Thuốc thử/Hoạt chất Cao TL hexane Cao TL ether dầu Cao TL EtOAc Cao TL EtOH Cao TL CH2Cl2 1 Liebermann- Burchar/Sterol - + + +++ ++ 2 Salkowski/Limonoid, Triterpenoid + - + ++ ++ 3 Shibata/Flavonoid, Benzopyron - - - ++ + 4 Bouchardat/Alcaloid, HC amin - - - - - 5 Mayer/Alcaloid, HC amin - - - - - 6 Fehling/Đường khử, HC aldehyde - - - - - 7 Gelatin mặn/Tanin, Arylphenol - + + + + 8 Dd FeCl3 1%/Tanin, Arylphenol - + + + + 9 Giấy lọc/chất béo +++ + + - -
Dấu – : không hiện màu
Dấu + : có hiện màu của nhóm chức hóa học tương ứng.
Thuốc thử Salkowski làm cho các limonoid hiện ra có màu xanh lục. Kết quả cho thấy có 6 limonoid:
1 limonoid ARL1 trong cao TL hexane 1 limonoid ARL2 trong cao TL ethyl acetate
32
2 limonoid ARL3, ARL4 trong cao TL ethanol
2 limonoid ARL5, ARL6 trong cao TL dichloromethan Gọi tên chung 6 limonoid này là ARLx.
Hình 3.1: Máy tách vỏ hạt neem.
33
Hình 3.3 : Trích hoạt chất ARL trong bánh neem trong hình Soxhlet
34
3.1.1.6. Tách các limonoid ARLx
Hòa tan 6 limonoid hiện ra trên sắc ký đồ ARL1, ARL2, ARL3, ARL4, ARL5, ARL6 trong các dung môi tương ứng, lọc bỏ tạp chất, chưng cất dưới áp suất thấp thu hồi dung môi; 6 limonoid đã được tách riêng ra ARL1, ARL2, ARL3, ARL4, ARL5, ARL6 có dạng đậm đặc. Hòa tan các limonoid ARLx trong nước cất thành 6 dung dịch ARLx 1%. Thử nghiệm tính sát khuẩn của 6 ARLx này đối với 2 chủngNitrosomonas sp và Nitrobacter sp.
3.1.2. Phân lập và nhân giống 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp 3.1.2.1. Phân lập và nhân giống chủng Nitrosomonas sp 3.1.2.1. Phân lập và nhân giống chủng Nitrosomonas sp
a. Phân lập và chọn giống
Lấy 1g đất trồng rau sâu khoảng 5-10cm, hòa vào 9ml nước cất, ly tâm loại cặn, pha loãng đến nồng độ thích hợp. Dùng pipetman hút 0,1ml dung dịch cho vào đĩa Petri có chứa môi trường Winogradsky P1; dùng que cấy, cấy trải dàn đều trên dung dịch mặt thạch. Ủ ở 28 ± 2oC trong 4 ngày, chọn và tách những khuẩn lạc tương đối rời.
Dùng que cấy vòng lấy một ít giống vi khuẩn hòa tan trong nước cất, cấy ria lên dĩa Petri chứa môi trường Winogradsky P1. Ủ 4-5 ngày ở nhiệt độ 30oC. Quan sát hình dáng của tế bào và sự sắp xếp của màng tế bào chất theo các tiêu chí phân loại vi khuẩn. (Hình 3.5)
Bảng 3.3 : Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Nitrosomonas sp.
TT Đặc điểm Vi khuẩn Nitrosomonas sp
1 Hình dạng Có dạng cầu, một số có dạng bầu dục 2 Kích thước (μm) 0,7 – 1,5 x 1,0 – 2,4
3 Kiểu tiên mao Mọc ở cực
4 Cấu trúc màng Màng bao tế bào chất có các lỗ nằm rãi rác đôi khi các màng này gấp cuộn vào bên trong tế bào chất.
5 Nhuộm Gram Thuộc loại Gram âm không di động
b. Nhân giống
Nuôi cấy chủng vi khuẩn Nitrosomonas sp trong bình lên men có chứa 1 lít dung dịch môi trường Watson ở nhiệt độ 30oC.
Theo dõi quá trình lên men bằng kỹ thuật đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu (Bảng 3.4). Sau 4 ngày nuôi cấy mật độ chủng Nitrosomonas sp trong dung dịch là: CFU/ml = 1,4 x 108.
35
Bảng 3.4: Mật độ chủng Nitrosomonas sp thay đổi theo thời gian nuôi cấy ở pH = 7 và to = 30oC.
TT Thời gian (giờ) pH to(C) Mật độ tế bào (CFU/ml)
1 12 7 30 1,2 x 106 2 24 7 30 7,4 x 106 3 36 7 30 2,2 x 107 4 48 7 30 5,6 x 107 5 60 7 30 0,8 x 108 6 72 7 30 1,1 x 108 7 84 7 30 1,3 x 108 8 96 7 30 1,4 x 108 c. Giữ giống
Đưa chủng Nitrosomonas sp vào môi trường giữ giống Winogradsky P1 trong ống nghiệm thạch nghiêng bảo quản ở 4oC.
3.1.2.2. Phân lập và nhân giống chủng Nitrobacter sp
a. Phân lập và chọn giống
Lấy 1g đất trồng rau sâu khoảng 5-10cm hòa vào 9ml nước cất, ly tâm loại cặn, pha loãng đến nồng độ thích hợp. Dùng pipetman hút 0,1ml dung dịch cho vào đĩa Petri có chứa môi trường Winogradsky P2; dùng que cấy, cấy trải dàn đều trên dung dịch mặt thạch. Ủ ở 28 ± 2oC trong 4 ngày, chọn và tách những khuẩn lạc tương đối rời.
Dùng que cấy vòng lấy một ít giống vi khuẩn hòa tan trong nước cất, cấy ria lên dĩa Petri chứa môi trường Winogradsky P2 mới pha. Ủ 4-5 ngày ở nhiệt độ 30oC. Quan sát hình dáng của tế bào và sự sắp xếp của màng tế bào chất theo các tiêu chí phân loại vi khuẩn. (Hình 3.6).
Bảng 3.5: Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Nitrobacter sp.
TT Đặc điểm Vi khuẩn Nitrobacter sp
1 Hình dạng Có dạng cầu, đôi khi có hình quả lê hay que ngắn 2 Kích thước (μm) 0,6 – 0,8 x 1,0 – 2,0
3 Kiểu tiên mao Mọc ở gần cực, đuôi và bên hông
4 Cấu trúc màng Carboxysome hiện diện ở tế bào chất ở dạng thể vùi trong nguyên sinh chất. Vách tế bào có thêm một lớp vỏ bọc bên
36
ngoài được cấu trúc bởi các tiểu đơn vị protein ghép với nhau theo một trật tự nhất định.
5 Nhuộm Gram Thuộc loại Gram âm di động nhờ tiên mao ở đuôi và bên hông.
b. Nhân giống
Nuôi cấy chủng vi khuẩn Nitrobacter sptrong bình lên men có chứa 1 lít dung dịch môi trường Hall-Murphy ở nhệt độ 30oC.
Theo dõi quá trình lên men bằng kỹ thuật đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu (Bảng 3.6). Sau 5 ngày nuôi cấy mật độ chủng Nitrobacter sptrong dung dịch là: CFU/ml = 1,15 x 108.
Bảng 3.6: Mật độ chủng Nitrobacter spsau 5 ngày nuôi cấy ở pH = 7 và to = 30oC.
TT Thời gian (giờ) pH to(C) Mật độ tế bào (CFU/ml)
1 24 7 30 1,73 x 106 2 48 7 30 8,25 x 106 3 72 7 30 2,43 x 107 4 96 7 30 9,86 x 107 5 120 7 30 1,15 x 108 c. Giữ giống
Đưa chủng Nitrobacter sp vào môi trường giữ giống Winogradsky P2 trong ống nghiệm thạch nghiêng bảo quản ở 4oC.
37 (a) (a) (b) Hình 3.5: Hình dạng khuẩn lạc Nitrosomonas sp. a) Sau 4 ngày b) Sau 9 ngày
38 (a) (b)