Thử nghiệm tính sát khuẩncủa 6 hoạt chất ARLx trích từ hạt neem đối với

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.3.Thử nghiệm tính sát khuẩncủa 6 hoạt chất ARLx trích từ hạt neem đối với

3.1.3.1. Vật liệu và môi trƣờng

a. Vi khuẩn thử nghiệm

TT Tên vi khuẩn Gram Đặc tính

1 Nitrosomonas sp (–) Nitrosomonas sp là một loại vi khuẩn hóa tự dưỡng

hình cầu, Gram (–), hoạt động háo khí, oxid hóa NH4+ và NH3 trong phân đạm thành NO2– trong điều kiện to: 20-34oC và pH=6,0-9,0.

2 Nitrobacter sp (–) Nitrobacter sp là một loại vi khuẩn hóa tự dưỡng hình

cầu, Gram(–), hoạt động háo khí, cộng sinh với

Nitrosomonas sp, oxid hóa NO2– thành NO3– ở nồng độ oxy ≥ 0,5ppm, to: 30-40oC và pH=6,5-8,5.

Các chủng vi khuẩn này được phân lập trong đất trồng rau có bón phân đạm, nuôi cấy, nhân giống và giữ giống trong môi trường Winogradsky P1 và P2 trong ống nghiệm thạch nghiêng, bảo quản ở 4oC và được cấy chuyền mỗi tháng 1 lần.

b. Mẫu thử nghiệm

Các hoạt chất ARL1,ARL2,ARL3, ARL4, ARL5, ARL6 (ARLx) được tách ra bằng phương pháp sắc ký bản mỏng điều chế từ các loại cao trích ly (TL) của nhân hạt neem. Các hoạt chất ARLx này được bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong chai có màu nâu sậm và đậy kín nắp.

c. Môi trường kháng sinh đồ

Môi trường Nutrient agar Cao thịt : 3g Pepton : 5g NaCl : 5g Agar : 20g Nước qsp : 1000ml 3.1.3.2. Thử nghiệm

a. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm

Từ các ống nghiệm thạch nghiêng giữ giống, vi khuẩn được cấy chuyền lên mặt thạch chứa môi trường giữ giống Winogradsky P1 và P2 tương ứng.

40

Ủ các hộp thạch có vi khuẩn ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 3-4 ngày. Sau khi các khuẩn lạc (vi khuẩn sinh sản mọc thành nhóm) xuất hiện, chọn 3-5 khuẩn lạc riêng lẻ giống nhau để làm một huyền phù dung dịch vi khuẩn trong ống nghiệm chứa 0,5% Tween 80 trong 5ml nước muối sinh lý sao cho mật độ vi khuẩn trong ống nghiệm khoảng 108 CFU/ml.

b. Chuẩn bị các hộp thạch thử nghiệm

Đun cách thủy hỗn hợp Nutrient agar đến tan hoàn toàn. Khử trùng bằng nồi hấp ở 121oC trong 30phút. Sau khi để nguội đến 50o

C bắt đầu phân phối ra các đĩa Petri vô trùng. Trong mỗi đĩa Petri có 38ml thạch tương đương với độ dày 4mm. Các hộp thạch này được ủ qua đêm để kiểm tra sự vô trùng. Loại bỏ các hộp thạch bị nhiễm.

Dùng que cấy tam giác vô trùng nhúng vào huyền phù dung dịch vi khuẩn đã chuẩn bị ở trên rồi trải đều chủng vi khuẩn thử nghiệm trên mặt thạch của môi trường Nutrient agar.

c. Làm kháng sinh đồ

Sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch (Dilution agar).

Dùng kẹp vô trùng kẹp đĩa giấy đường kính 5mm đã tẩm mẫu dung dịch 1% trong nước của 6 hoạt chất ARLx đặt lên mặt thạch thử nghiệm. Làm tương tự với mẫu trắng (đĩa giấy tẩm nước cất). Lật ngược hộp thạch và ủ ở 30oC. Sau 24giờ đọc kết quả đường kính vòng vô khuẩn tức là vòng không có vi khuẩn mọc xung quanh đĩa giấy tẩm mẫu dung dịchhoạt chất ARLx thử nghiệm.

3.1.3.3. Kết quả

Kết quả sát khuẩn của các hoạt chất ARLx trích từ hạt neem đối với 2 chủng

Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp được trình bày trong bảng sau đây (Bảng 3.7)

Bảng 3.7: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các hoạt chất ARLx đối với 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp.

TT Hoạt chất ARLx Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm)

Đối chứng Nitrosomonas sp Nitrobacter sp

1 ARL1 5 8 8 2 ARL2 5 6 5 3 ARL3 5 6 5 4 ARL4 5 10 8 5 ARL5 5 9 8 6 ARL6 5 6 5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

41

Bảng kết quả cho thấy 3 chất ARL1, ARL4, ARL5 có tác dụng khử Nitrosomonas sp

và Nitrobacter sp mạnh nhất (Hình 3.7, 3.8). Đo đó cần phải định danh và ly trích 3 hoạt chất ARLx này trong hạt neem để điều chế Limo NI.

Hình 3.7: Đường kính vòng vô khuẩn của ARL1, ARL4, ARL5 đối với chủng Nitrosomonas

spso với mẫu trắng.

ARL1

ARL4

42

Hình 3.8: Đường kính vòng vô khuẩn của ARL1, ARL4, ARL5 đối với chủngNitrobacter sp

so với mẫu trắng.

ARL1

ARL4

43

3.1.3.4. Định danh các hoạt chất ARL1, ARL4, ARL5

a. Định danh ARL1

ARL1 được cô lập dưới dạng tinh thể không màu Dđ 205oC (MeOH), tan tốt trong ether, alcohol, tan ít trong nước.

Phân tích nguyên tố ARL1 với máy HR-MS tại trường Đại học Khoa học tự nhiên TP HCM cho kết quả:

C: 66.65%; H: 6.71%; O: 26.64% Phổ MS có các mũi đặc trưng:

m/z: 540.6 (M+, 21); 363 (71); 303 (100); 289 (78) Từ đó suy ra công thức nguyên của ARL1 là C30H36O9  Phổ UV λCĐnm: 210 (ε = 32.700); 330 (ε = 66)

 Phổ 1H-NMR và 13C-NMR

Phổ 1H-NMR của ARL1 có 5 mũi đơn ứng với 5 nhóm Me ở 1.22 (3H, s, H-19), 1.29 (3H, s, H-30),1.59 (3H, s, H-29), 1.69 (3H, s, H-18), 1.95 (3H, s, H-32); 2 nhóm MeO ở 3.66 (3H, s, MeO-12) và 3.70 (3H, s, MeO-28). Phổ 13C-NMR có 28 tín hiệu carbon, cho thấy nó là một limonoid (tetranortriterpen) [43]. Hai mũi đôi ở 5.86 (1H, d, J=10.5 Hz, H-2) và 6.42 (1H, d, J=10.5 Hz, H-3) trên phổ 1H-NMR, cùng với tín hiệu carbon ở 202.2 trên phổ 13C-NMR cho thấy vòng A của chất này có một nhóm liên hợp 2-en-1-on của nimbin. Ba tín hiệu một proton ở 7.33 (1H, t, J=H-21); 7.24 (1H, s, H-23) và 6.33 (1H, s, H-22) chứng tỏ sự hiện diện của một vòng furane. Khi so sánh các tín hiệu proton ở 5.56 (1H, m, H-15) và 4.03 (1H, d, J=2.1, H-7) cùng với các tín hiệu carbon ở 87.5 (C-7) và 87.0 (C-15) với số liệu phổ của nimbin thì thấy sự hiện diện của một liên kết eter giữaC-7 và C-15 như trong cấu trúc của nimbin.Các tín hiệu proton và carbon còn lại cũng khẳng định giả thuyết này. Ví dụ như tín hiệu nối đôi ở 146.9 (C-14) và 134.9 (C-13); tín hiệu của hai nhóm MeO ở 51.7 và 53.0.

So sánh các số liệu phổ này với phổ của những hợp chất đã công bố trước đây về nimbin [44] cho thấy ARL1 là nimbin (Phụ lục 1, 2).

44

b. Định danh ARL4

Chất ARL4 được cô lập dưới dạng bột vô định hình, màu trắng, tan tốt trong CHCl3 và MeOH. Sắc ký bản mỏng với dung môi giải ly CHCl3:MeOH tỷ lệ 9:1 và hiện màu bằng thuốc thử Salkowski cho vết tròn màu xanh lục, Dđ 154-158oC tan tốt trong EtOH, EtOAc, CH3COCH3, tan ít trong nước.

Phân tích nguyên tố ARL4 cho kết quả: C : 58,33% ; H : 6,15% ; 0:35,52%  Phổ FAB – MS cho các mùi đặc trưng

m/z : 720.7 (M+,18); 544 (68); 483 (100); 469 (75) Từ đó suy ra công thức nguyên của ARL4 làC35H44O16  Phổ UV(MeOH) λCĐnm: 217 (ε:9100)

 Phổ1H-NMR của ARL4 có tín hiệu của hai proton olefin của vòng dihydrofurane ở 5.05 (1H, d, J=2.5 Hz, H-22) và 6.46 (1H, d, J=2.5 Hz, H-23); một proton acetal ở 5.65 (1H, s, H-21). Ngoài ra còn có một proton olefin của nhóm tigloyl xuất hiện ở 6.92 (1H, m, H- 3’). Trên phổ còn có tín hiệu bốn mũi đơn ứng với bốn nhóm CH3 ở 1.75 (3H, s, H-4’), 1.86 (3H, s, H-5’) và 2.01 (3H, s, H-18). Phổ còn cho tín hiệu của hai nhóm – OCH3 xuất hiện ở 3.69 (3H, s, C12-OCH3) và 3.80 (3H, s, C29-OCH3). Tại vị trí 1.95 (3H, s, C3-OAc) là một mũi đơn đặc trưng cho nhóm chức - OAc cũng hiện diện trong cấu trúc.

So sánh số liệu phổ này với phổ của những hợp chất đã công bố trước đây từ cây neem cho thấy ARL4 là azadirachtin [43,45] (Phụ lục 3, 4).

45 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

c. Định danh ARL5.

ARL5 được cô lập dưới dạng tinh thể không màu, Dđ 167-170o (EtOH); tan trong EtOH, ether, tan ít trong nước.

Phân tích nguyên tố cho kết quả:

C: 68.46% H: 7.38% O: 24.16%  Phổ FAB-MS cho các mũi đặc trưng

m/z : 596 (M+,28); 479(46); 438(41); 379(37); 319(73); 252(100) Từ đó suy ra công thức nguyên của ARL5 là C34H44O9

 Phổ 1H-NMR:

ppm : 1.0 (3H, s, H-24) ; 1.23 (3H, s, H-25); 1.33 (3H, s, H-22); vinyl Me 1.69 (3H, d, J=1.5 Hz, H-26); carbomethoxy 3.28 (3H, s,CO2Me); Me acetat 1.95 (3H, s, CH3COO); Tiglat ester 7.00 (1H, m, H-vinyl) và 1.75-2 (6H, m, 2CH3); vòng furane trí hoán 7.35 (2H, m, H-vinyl) và 6.33 (1H, s, H-vinyl)

Sắc ký bản mỏng sillica gel với các dung ly khác nhau và dùng thuốc hiện màu Salkowski gồm vanillin – H2SO4 đđ – ethanol (3:1:100 w/v/v) cho kết quả như sau:

46

Hệ dung ly Rf

Dichloromethan 0

Diethyl ether 0.33

Diethyl ether : methanol (99:1) 0.47 Dichloromethan : methanol (19:1) 0.59

So sánh các kết quả trên với các số liệu đã công bố trước đây (38) chúng tôi kết luận chất ARL5 là salannin có cấu trúc như sau:

47