III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.4. Lập công thức pha chế Limo NI bền nhiệt và bền nhũ
3.2.4.1. Công thức pha chế Limo NI
Công thức pha chế Limo NI dựa vào tính chất các thành phần và tính năng sử dụng của chế phẩm
61 Thành phần của Limo NI gồm có (%):
Cao hạt neemchứa 5% hoạt chất ARL(azadirachtin, salannin, nimbin) : 25,0
Chất làm bền ESO : 5,0
Chất tạo nhũ Sucroester : 10,0 Chất kết dính Rosin : 10,0
Dung môi ethanol : 50,0
100,0
Cho các thành phần trên vào máy trộn, khuấy trộn thật đều với vận tốc khuấy 1.000 vòng/phút, trong 60 phút ở nhiệt độ phòng, chế phẩm thu được là Limo NI.
3.2.4.2. Tính chất của Limo NI
Chế phẩm Limo NI có các tính chất như sau:
STT Chỉ tiêu ĐVT Phƣơng pháp Kết quả
1 Tỷ trọng g/ml TCVN 2629-2007 0,93
2 Độ ẩm % 10TCN 302-97 2
3 Hàm lượng hữu cơ tổng số % AOAC 2007 (967.05) 71,2 4 Hàm lượng hoạt chất tan trong CH3OH % AOAC 1997 (576.06) 54,8 (ở 30oC)
3.2.4.3. Định lƣợng hoạt chất ARL trong Limo NI
Trong những limonoid trích từ cây neem, azadirachtin có hàm lượng cao nhất và có tác dụng mạnh nhất đối với côn trùng nên các nhà hóa học trên thế giới thông nhất chọn azadirachtin (AZ) làm chất đặc trưng của các limonoid ARL có cấu trúc và công dụng tương tự AZ chiết xuất từ các bộ phận của cây neem. Để định lượng hoạt chất ARL gồm azadirachtin, salannin, nimbin trong Limo NI chúng tôi dựa vào đường chuẩn của AZ dựng theo định luật Beer Lambert dùng trong phương pháp so màu.
a. Xây dựng đường chuẩn của AZ dùng để định lượng ARL
Chất chuẩn AZ 95% tinh khiết được nhập từ công ty Sigma Chemical (Đức)
Pha 6 dung dịch chuẩn AZ 95% trong CH2Cl2 có nồng độ: 0,01mg/ml; 0,02mg/ml; 0,04mg/ml; 0,06mg/ml; 0,08mg/ml; 0,1 mg/ml. Với mỗi nồng độ thực hiện các công đoạn như sau:
62
Cho 1ml dung dịch chuẩn AZ 95% trong CH2Cl2 vào ống nghiệm, cho vào tiếp 0,2ml dung dịch vanillin trong MeOH (0,02 mg/ml). Lắc mạnh hỗn hợp và để yên ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Cho tiếp 0,3ml H2SO4 98% (chia làm 3 lần mỗi lần 0,1ml, sau mỗi lần cho H2SO4vào lắc mạnh trong 10 giây.
Cho thêm 0,5ml MeOH để đồng nhất 2 pha của hỗn hợp. Lúc này dung dịch chuyển ra màu xanh lục. Để yên trong 5 phút để ổn định màu.
Đo độ hấp thu A (absorbance) của 6 dung dịch chuẩn thực hiện giống nhau như trên, ở λ=577nm trên quang phổ kế tử ngoại, so với mẫu trắng chứa cùng thành phần nhưng không có AZ 95%.
Vẽ đường biểu diễn (đường chuẩn) trên trục tọa độ, trục hoành ghi nồng độ c của dung dịch chuẩn AZ, trục tung ghi độ hấp thu A tương ứng. Đường chuẩn là một đường thẳng qua tâm tọa độ: (Phụ lục 9b)
Đường chuẩn này có phương trình: y = 8,70x + 0,003
R2 = 0,9999
x là nồng độ C (g/ml) của các limonoid ARL y là độ hấp thu A ở = 577nm.
Dựa vào đường chuẩn này để suy ra hàm lượng ARL trong chế phẩm.
b. Định lượng ARL trong Limo NI
Hòa tan trong ống nghiệm 5mg chế phẩm Limo NI (pha theo công thức ghi trong 3.2.4.1) trong 10 ml CH2Cl2. Dung dịch mẫu có nồng độ
c1 = 0,5mg/ml
Cho thuốc thử Salkowski vào ống nghiệm lắc đều để ổn định màu trong 15 phút. Đo A trên quang phổ kế UV so với mẫu trắng
A = 0,2362 – 0,1772 = 0,0590 (Phụ lục 10) Dựa vào đường chuẩn của azadirachtin trong phụ lục 9b suy ra:
c2 = 0,0064mg/ml
Như thế trong 0,5 mg dung dịch mẫu có 0,0064mg ARL. Do đó hàm lượng ARL trong chế phẩm Limo NI là :
63
3.2.4.4. Thử nghiệm độ bền nhiệt của Limo NI
Chất làm bền ESO được thử nghiệm khả năng làm bền Limo NI qua các thử nghiệm sau đây:
a. Nội dung thử nghiệm
Theo dõi các chỉ tiêu lý hóa
Ảnh hưởng của ESO lên tính bền nhiệt của các hoạt chất ARL trong Limo NI.
Theo phương pháp gia tốc CIPAC vol F, MT 46.1.3, mẫu được giữ ở nhiệt độ 54oC ±2 trong vòng 14 ngày đêm. Sau khi hoàn tất, phân tích hàm lượng hoạt chất ARL trong sản phẩm trước gia tốc (TGT) và sau gia tốc (SGT). Thử nghiệm về độ bền nhiệt này tương ứng với độ bền của mẫu sản phẩm được giữ trong 2 năm tại nhiệt độ môi trường.
b. Tiến hành thử nghiệm
Pha Limo NI theo 2 công thức (CT) như sau:
Limo NI (CT1): Limo NI có 5% chất làm bền ESO. Limo NI (CT2): Limo NI không có chất làm bền ESO.
Định lượng ARL trong Limo NI với máy UV Cary 50, dựa vào đường chuẩn của AZ dùng trong phương pháp so màu trước gia tốc (TGT) và sau gia tốc (SGT).
c. Kết quả thử nghiệm
Ngoại quan sản phẩm
Cả 2 công thức Limo NI (CT1) và (CT2) sau khi pha chế có màu vàng nhạt trong suốt.
Khả năng làm bền limonoid của ESO
Hàm lượng hoạt chất ARL trong sản phẩm Limo NI (CT2 không cóchất làm bền ESO) trước GT và SGT như sau:
TGT: 1,28% SGT: 0,21% Hàm lượng AZ bị giảm: 83,59%%
Hàm lượng hoạt chất ARL trong sản phẩm Limo NI (CT1 có 5% ESO) TGT và SGT như sau:
TGT: 1,28% SGT: 1,15% Hàm lượng ARL bị giảm: 10,16%
64
3.2.4.5. Thử độ bền nhũ của Limo NI
Chất nhũ hóa sucroester được thử nghiệm khả năng nhũ hóa Limo NI qua các thử nghiệm sau đây:
a. Nội dung thử nghiệm
Theo dõi các chỉ tiêu lý hóa.
Ảnh hưởng của sucroester lên khả năng bền nhũ của Limo NI.
Theo CIPAC vol F, MT 36, để xác định khả năng gây nhũ người ta xác định thời gian tách lớp của dung dịch chất hoạt diện cần đo ở nồng độ và thể tích nhất định với một thể tích parafin nhất định. Thông thường tỷ lệ (v/v) của dung dịch chất hoạt diện và parafin là 1:1, thời gian tách lớp càng lâu, khả năng nhũ càng mạnh.
b. Tiến hành thử nghiệm
Hòa tan 1g Limo NI trong 20ml nước cất trong erlen 500ml. Thêm vào 20ml kerosene, lắc đều hỗn hợp trong 2 phút.
Lấy ngay 10ml hỗn hợp cho vào ống nghiệm, bấm đồng hồ đo giây để đo thời gian tách lớp hoàn toàn.
c. Kết quả thử nghiệm
Ngoại quan sản phẩm
Dung dịch nhũ dầu trong nước (o/w) của Limo NI có màu trắng đục không lắng cặn, không có lớp ván dầu trên mặt. (Hình 3.16)
Khả năng nhũ hóa
Sản phẩm có độ tự nhũ, độ bền nhũ tốt.
Thời gian tách lớp hoàn toàn là 75 phút. (Thời gian tách lớp quy định là ≥ 20ph) [50]. Kết quả này chứng tỏ sucroester điều chế được có khả năng gây nhũ tốt chế phẩm Limo NI trong dầu và nước.
65
Hình 3.16: Dung dịch nhũ dầu trong nước (o/w) của Limo NI.
3.2.4.6. Giải trình công thức pha chế Limo NI
a. Thành phần cao hạt neem
Cao hạt neem chứa 5% hoạt chất ARL (gồm azadirachtin, salannin, nimbin) chiếm tỷ lệ 25% trong chế phẩm Limo NI. Như thế trong chế phẩm Limo NI hoạt chất ARL có hàm lượng 1,25% và theo kết quả định lượng ARL bằng quang phổ kế UV (xem 3.2.4.3) thì hàm lượng của ARL trong Limo NI là 1,28% (sai số 0,023% là do khâu pha chế). Chúng tôi chọn hàm lượng này là vì khi làm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán trên thạch (xem 3.1.3.1), chúng tôi đã dùng dung dịch ARL 1% trong nước thì dung dịch này đã có tính sát khuẩn khá tốt đối với 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp, tác nhân nitrit hóa phân
66
đạm. Do đó trong thành phần của Limo NI, cao hạt neem chứa 5% ARL chiếm tỷ lệ 25% là thích hợp.
b. Thành phần chất làm bền ESO
Để làm bền các chế phẩm có chứa ARL trích từ hạt neem, hiện nay trên thế giới người ta dùng 2 chất là PABA (para-aminobenzoic acid) tỷ lệ 1% đối với chế phẩm có chứa ARL và ESO (epoxydised soybean oil) tỷ lệ 3-5% đối với chế phẩm có chứa ARL. Trong các đề tài và dự án nghiên cứu trước đây về các hoạt chất ARL ly trích từ cây neem [39,40, 41] chúng tôi đã tổng hợp và sử dụng ESO với tỷ lệ 5% để làm bền các chế phẩm có chứa ARL. Trong công thức pha chế Limo NI này chúng tôi cũng dùng ESO với tỷ lệ 5% để làm bền chế phẩm Limo NI. Kết quả thử độ bền nhiệt của Limo NI (xem 3.2.4.1) cho thấy chất ESO với hàm lượng 5% có khả năng làm bền tốt chế phẩm Limo NI.
c. Chất tạo nhũ Sucroester
Để nhũ hóa các hợp chất dầu trong nước, hiện nay người ta sử dụng nhiều chất hoạt diện không ion trong đó có sucroester theo tỷ lệ 10-25% so với dầu. Trong các đề tài và dự án nghiên cứu trước đây về các hoạt chất ARL [39,40,41] chúng tôi cũng đã tổng hợp và sử dụng sucroester với tỷ lệ 8-12% đối với chế phẩm có chứa ARL để nhũ hóa các chất dầu trong nước. Trong công thức pha chế Limo NI này chúng tôi cũng sử dụng sucroester với tỷ lệ 10% để nhũ hóa Limo NI trong đó có 40% dầu (tức 25% so với dầu). Kết quả thử độ bền nhũ của Limo NI (xem 3.2.4.5) cho thấy sucroester với tỷ lệ 10% so với Limo NI có khả năng gây nhũ tốt chế phẩm Limo NI.
d. Chất kết dính Rosin
Chất kết dính rosin được điều chế từ nhựa dầu thông là một chất tự nhiên có độ bám dính trung bình giúp chế phẩm Limo NI bám sát vào hạt urê, ngăn chặn các vi khuẩn nitrit hóa phân đạm bám vào phân urê để phân giải urê và đồng thời rosin cũng phân giải chậm, không lưu bả độc trong môi trường và giúp urê hòa tan dần dần trong đất để cây trồng có thể hấp thu. Sau nhiều lần thử nghiệm cho thấy tỷ lệ rosin 10% trong chế phẩm Limo NI là thích hợp để bọc urê.
3.2.5. Giá thành sản phẩm
3.2.5.1. Giá thành 1kg hỗn hợp ARL chứa 5% hoạt chất.
a. Nguyên liệu, hóa chất (NVL)
Hạt neem: 12,5kg x 12.000 đ/kg = 150.000đ Ether dầu: 3l x 18.000đ/l = 54.000đ Ethanol: 4,5l x 12.000đ/l = 54.000đ Benzene: 2l x 18.000đ/l = 36.000đ
67
Ethyl acetate: 0,5l x 24.000đ/l = 12.000đ 306.000đ
b. Điện nước, xăng dầu
Định mức 5,5% NVL: 306.000đ x 5,5% = 16.800đ
c. Công lao động
Định mức 13% NVL: 306.000đ x 13% = 39.800đ
d. Khấu hao thiết bị nhà xưởng
Định mức 16,5% NVL: 306.000đ x 16,5% = 50.500đ
e. Chi phí quản lý
Định mức 7,5% NVL: 306.000đ x 7,5% = 23.800đ
Cộng: 436.900đ
Giá thành 1kg hỗn hợp ARL chứa 5% hoạt chất là 436.900đ/kg
3.2.5.2. Giá thành 1kg chất làm bền ESO.
a. Nguyên liệu, hóa chất (NVL)
Dầu đậu nành: 10kg x 12.000 đ/kg = 120.000đ Formic acid: 0,46kg x 25.000đ/kg = 11.500đ H2O2 45%: 3,82kg x 20.000đ/kg = 76.400đ Na2CO3: 1kg x 15.000đ/kg = 15.000đ MgSO4: 0,1kg x 21.000đ/kg = 2.100đ 225.000đ
b. Điện nước, xăng dầu
Định mức 5,5% NVL: 225.000đ x 5,5% = 11.250đ
c. Công lao động
Định mức 13% NVL: 225.000đ x 13% = 31.500đ
d. Khấu hao thiết bị nhà xưởng
Định mức 16,5% NVL: 225.000đ x 16,5% = 37.130đ
e. Chi phí quản lý
Định mức 7,5% NVL: 225.000đ x 7,5% = 23.800đ
68 Sản phẩm ESO thu được: 10,15kg
Giá thành 1kg ESO là 322.760đ/10,15kg = 31.800đ/kg Hiện nay giá nhập 1kg chất làm bền ESO là 3,6USD/kg.
3.2.5.3. Giá thành 1kg chất làm gây nhũ sucroester.
a. Nguyên liệu, hóa chất (NVL)
Sucrose: 2,06kg x 12.000 đ/kg = 24.720đ Ethyl laurat: 1,56kg x 20.000đ/kg = 31.200đ Lipase: 10g x 1.000đ/kg = 10.000đ Butanol hao: 1l x 15.000đ/l = 15.000đ Hexane hao: 0,2l x 40.000đ/l = 8.000đ Cyclohexane hao: 0,2l x 20.000đ/l = 4.000đ 92.920đ
b. Điện nước, xăng dầu
Định mức 5,5% NVL: 92.920đ x 5,5% = 4.650đ
c. Công lao động
Định mức 13% NVL: 92.920đ x 13% = 13.010đ
d. Khấu hao thiết bị nhà xưởng
Định mức 16,5% NVL: 92.920đ x 16,5% = 14.870đ
e. Chi phí quản lý
Định mức 7,5% NVL: 92.920đ x 7,5% = 6.970đ
Cộng: 132.420đ
Sản phẩm sucroester thu được: 1,4kg
Giá thành 1kg sucroester là 132.420đ/1,4kg = 94.590đ/kg Hiện nay giá nhập 1kg sucroester là 6,2USD/kg.
3.2.5.4. Giá thành 1kg Limo NI.
a. Nguyên liệu, hóa chất (NVL)
Hỗn hợp ARL: 25% x 436.900 đ = 109.230đ Chất làm bền ESO: 5% x 31.800đ = 1.590đ Chất tạo nhũ sucroester: 15% x 94.590đ = 14.190đ
69
Chất kết dính rosin: 10% x 65.000đ = 65.00đ Dung môi ethanol: 40% x 12.000đ = 4.800đ
136.310đ
b. Chi phí điện nước, xăng dầu: 5% NVL: = 6.820đ
c. Công lao động:13% NVL = 17.720đ
d. Khấu hao thiết bị nhà xưởng: 16,5% NVL = 22.490đ
e. Chi phí quản lý: 7,5% NVL = 10.220đ
Cộng: 193.560đ
Giá thành 1kg Limo NI là 193.560đ/kg.
Giá chào bán của chất Nitrapyrin tên thương mại N-Serve có cùng công dụng được chào bán với giá 18 USD/kg.
3.2.6. Xác định LD50 của hoạt chất ARL trong Limo NI đối với chuột bạch
Theo phương pháp Sun R. [51]
3.2.6.1. Đối tƣợng thử nghiệm
Giống chuột bạch Swiss-Webster do Bộ môn Sinh lý Động vật trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp.HCM cung cấp có độ tuổi trưởng thành sinh lý, trọng lượng khoảng 20-30g.
Chuột được mang về phòng thí nghiệm nuôi riêng mỗi con trong 1 lồng để theo dõi sức khỏe trong 7 ngày trước khi thử nghiệm.
Trong mỗi thí nghiệm chọn 5 con đực và 5 con cái khỏe mạnh, cho nhịn ăn trong 4 giờ trước khi uống thuốc.
3.2.6.2. Phƣơng pháp
Dùng ống bơm thuốc, bơm dung dịch hoạt chất ARL củaLimo NI trong nước (1:3 w/w) vào thẳng bao tử của chuột. Thực hiện 3 thí nghiệm sơ bộ với 3 nồng độ Limo NI khác nhau: 1,0g/kg, 1,5g/kg, 2,0g/kg. Trong mỗi thí nghiệm cho 10 con chuột bạch (5 cái + 5 đực) uống mỗi con 1 liều cùng nồng độ. Sau 1 giờ cho chuột ăn lại bình thường.
Theo dõi số chuột chết trong 5 ngày.
3.2.6.3. Kết quả
Theo kết quả thử nghiệm mà chúng tôi đã thực hiện, kết hợp với Bộ môn Sinh lý Động vật trường Đại học Khoa học Tự nhiên [39] thì hoạt chất ARL trong Limo NI có LD50 đối với chuột bạch qua đường miệng (oral) là:
70 LD50 (o) = 1,25g/kg
Như thế hoạt chất ARL có độ độc thấp hơn thuốc Aspirine (Aspirine có LD50đối với chuột bạch là 1,1g/kg) [52]. Theo bảng phân loại độ độc của các hóa chất Gosselin, Smith and Modge Scale dựa vào LD50 thì Limo NI thuộc loại hóa chất không độc.
Gần đây các nhà hóa học Mỹ đã nghiên cứu độc tính của hoạt chất ARL trong chế phẩm Margosan-O, một loại thuốc bảo vệ thực vật điều chế từ hạt neem và kết quả nghiên cứu này đã được Cơ quan Bảo vệ Môi trường Mỹ (EPA) chấp nhận cho đăng ký bán khắp nước Mỹ (Bảng 3.9).
Bảng 3.9: Độc tính của chế phẩm Margosan-O.
TT Thử nghiệm Nồng độ
1 Chim cút LD50 (uống dạng đậm đặc) 1 – 16ml/kg 2 Chim cút bạch LD50 (pha trong đồ ăn) > 7000 ppm/h
3 Cá hồi LD50 8,8ml/l
4 Chuột cống chết ngay 5ml/kg
5 Chuột cống bất tỉnh ngay LD50 > 2ml/kg 6 Chuột bạch bị mê qua đường hô hấp trong 1 giờ > 43,9 ml/l/h 7 Chuột lang, bị dị ứng trong 6 giờ Không
8 Ong mật LD50 > 4478 ppm/h
3.3. NỘI DUNG 3: XÂY DỰNG MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐO LƢỢNG NITRAT HÒA TAN TRONG NƢỚC VÀ THẤM SÂU VÀO ĐẤT
3.3.1. Mô hình thử nghiệm
Thử nghiệm được thực hiện trong thùng bằng thép không rỉ hình trụ đường kính 1,2m x cao 1,5m đáy hình nón có máy khuấy trộn và van xả nước, chứa đầy đất trồng cây pH=7. Cho 1kg phân đạm (urê) rải đều và trộn với lớp đất mặt sâu khoảng 5-15cm; sau 20 ngày tưới đều 15l nước sạch trên bề mặt đất trong thùng, xả van đáy thùng lấy nước ra trộn đều để định lượng nitrat. (Hình 3.17).
3.3.2. Định lƣợng nitrat
Hàm lượng nitrat trong nước được định lượng theo TCVN 7323-1:2004 dựa vào phản ứng của nitrat với 2,6-dimethylphenol cho ra 4-nitro-2,6-dimethylphenol có màu. Đo độ hấp thu A của sản phẩm màu sinh ra trong nước bằng quang phổ kế tử ngoại UV ở bước sóng 324nm và suy ra nồng độ nitrat trong mẫu thử dựa theo đường chuẩn.
71
3.3.2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn.
a. Lần lượt dùng pipet hút 1, 5, 10, 15, 20 và 25ml dung dịch tiêu chuẩn nitrat có nồng độ nitơ nitrat c(N) = 0,1mg/ml vào 1 dãy 6 bình định mức dung tích 100ml. Thêm nước cho tới vạch mức. Các dung dịch này có chứa 1, 5, 10, 15, 20, 25mg nitơ nitrat trong