III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. NỘI DUNG 2: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC ĐIỀU CHẾ LIMO NI
3.2.1. Ly trích 3 hoạt chất azadirachtin, salannin, nimbin trong nhân hạt neem
3.2.1.1. Ly trích azadirachtin (AZ)
a.Hình 3.9: Quy trình ly trích chọn lọc azadirachtin trong nhân hạt neem.
C35H44O16: chất rắn vàng nhạt, không mùi, vị đắng. λCĐ(MeOH): 217nm; ε = 9.100
Tan tốt trong EtOH, EtOAc, CH3COCH3, tan khoảng 4% trong nước ở 25oC.
b. Định lƣợng AZ với máy HPLC-UV
i. Xây dựng đường chuẩn.
Chất chuẩn AZ 95% tinh khiết nhập từ công ty Sigma Chemical (Đức). Bột nhân hạt
neem (1kg)
- Trích trong bình cầu có ống sinh hàn hoàn lưu với EtOH (3l) ở to=50oC trong 24giờ.
- Lọc Dd ethanol
- Chưng cất áp suất thấp thu hồi ethanol. Cao ethanol
- Chiết với ethyl acetat 3 lần
- Chưng cất áp suất thấp thu hồi ethyl acetat Cao ethyl acetat
- Sắc ký trên cột silicagel 60 H Merck, dung môi giải ly hexane/ethyl acetat (1:3).
- Thu hồi dung môi Chế phẩm AZ
48
Pha 3 dung dịch chuẩn AZ 95% trong MeOH có nồng độ: c = 7,25 mg/l 14,50 mg/l 21,75 mg/l Chạy HPLC-UV với các thông số sau:
Instrument: HPLC-UV Shimadzu tại trường Đại học Khoa học tự nhiên TP HCM. (Hình 3.10)
Packing column: Sulpeco C18, 250mm x 4,6 mm, 5 μm. Eluent: ACN : H2O (40 : 60).
Flow rate: 0,8 ml/min.
Detection: UV detector, 217nm. Sample loop: 20 μI.
Peak area (PA) được tính bằng μV.s .
c1 = 7,25 mg/l PA1 = 76.976 c2 = 14,50 mg/l PA2 = 156.987 c3 = 21,75 mg/l PA3 = 236.998
Vẽ đường chuẩn PA = f(c) của azadirachtin (Phụ lục 5a) Đường chuẩn này có phương trình:
y = 11036x – 3035 R2 = 0,9987
x là nồng độ C (g/ml) của azadirachtin
y là diện tích PA của mũi hấp thu ở = 217nm.
Dựa vào đường chuẩn này để suy ra hàm lượng azadirachtin trong mẫu.
ii. Định lượng AZ.
Chế phẩm AZ (75g) ly trích từ 1kg nhân hạt neem theo hình 3.9 được gửi đến phòng thí nghiệm Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp Hồ Chí Minh để xác định hàm lượng azadirachtin.
Xử lý mẫu:
Mẫu cân được 4,3mg, hòa tan trong methanol, siêu âm 5 phút cho tan hoàn toàn, định mức lên 5ml trong bình định mức. Sau đó dung dịch mẫu được cho qua cột SPE với dung môi giải ly methanol, mẫu qua cột được định mức lên 5ml và tiêm vào máy.
49 Tính toán kết quả (Phụ lục 6a, 6b):
Máy HPLC-UV cho 1 mũi azadirachtin RT: 13.312 min với PA: 671.814mV (giá trị y).
Dựa vào phương trình đường chuẩn: y = 11.036x – 3035 suy ra nồng độ azadirachtin trong dung dịch mẫu là:
x = 61,150mg/l
Nồng độ của dung dịch mẫu là:
Vậy hàm lượng azadirachtin % trong mẫu là:
Hình 3.10: Máy HPLC-UV dùng để đo hàm lượng azadirachtin.
50
a.Hình 3.11: Quy trình ly trích chọn lọc salannin trong nhân hạt neem.
C34H44O9: tinh thể vàng nhạt, không mùi, vị đắng.
Tan tốt trong ether, ether dầu, benzene, chloroform, MeOH, tan khoảng 5% trong nước ở 25oC.
b. Định lượng salannin với máy UV
Salannin có cấu trúc limonoid nên tạo màu xanh lục với thuốc thử Salkowski. Do đó salannin có thể được định lượng bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế tử ngoại UV Cary 50 tại trường Đại học Khoa học tự nhiên TP HCM (Hình 3.12) dựa vào đường chuẩn xây dựng theo định luật Beer Lambert. Chất chuẩn salannin 95% tinh khiết được nhập từ Công ty Sigma Chemical (Đức).
i. Xây dựng đường chuẩn.
Cao hexane Bột hạt neem
(1kg)
- Hòa tan với ether tỷ lệ v/v (1:1)
- Sắc ký qua cột silica gel 60 H Merck, giải ly với ether.
- Thu hồi dung môi Cao ether
- Hòa tan trong 200ml MeOH, lọc và pha loãng với MeOH-H2O (3:2)
- Sắc ký qua cột ODS RP-18 Merck, giải ly với hệ dung môi MeOH-H2O (3:2)
- Thu hồi dung môi Chế phẩm salannin
(49g)
- Trích trong bình cầu có ống sinh hàn hoàn lưu với 3l n-hexane ở nhiệt độ to=50oC trong thời gian 24 giờ.
51
Pha 6 dung dịch chuẩn salannin 95% trong CH2Cl2 có nồng độ: 0,01mg/ml; 0,02mg/ml; 0,04mg/ml; 0,06mg/ml; 0,08mg/ml; 0,1 mg/ml. Với mỗi nồng độ thực hiện các công đoạn như sau:
Lấy 1ml dung dịch chuẩn salannin trong CH2Cl2 cho vào ống nghiệm, cho vào tiếp 0,2ml dung dịch vanillin trong MeOH (0,02 mg/ml). Lắc mạnh hỗn hợp và để yên ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Cho tiếp 0,3ml H2SO4 98% (chia làm 3 lần mỗi lần 0,1ml, sau mỗi lần cho H2SO4vào lắc mạnh trong 10 giây.
Cho thêm 0,5ml MeOH để đồng nhất 2 pha của hỗn hợp. Lúc này dung dịch chuyển sang màu xanh lục. Để yên trong 5 phút để ổn định màu.
Đo độ hấp thu A (absorbance) của 6 dung dịch chuẩn thực hiện giống nhau như trên, ở λ=577nm trên quang phổ kế tử ngoại, so với mẫu trắng chứa cùng thành phần nhưng không có salannin.
A = A2 – A1
A2 là độ hấp thu của mẫu có chứa hoạt chất salannin.
A1 là độ hấp thu của mẫu trắng không chứa hoạt chất salannin.
Vẽ đường biểu diễn (đường chuẩn) trên trục tọa độ, trục hoành ghi nồng độ c của dung dịch chuẩn, trục tung ghi độ hấp thu A tương ứng. Đường chuẩn là một đường thẳng qua tâm tọa độ (Phụ luc 5b).
Đường chuẩn này có phương trình: y = 8,7002x + 0,0031
R2 = 0,9999
x là nồng độ C (g/ml) của salannin y là độ hấp thu A ở = 577nm.
Dựa vào đường chuẩn này để suy ra hàm lượng salannin trong mẫu.
ii. Định lượng salannin
Hòa tan trong ống nghiệm 5mg chế phẩm salannin điều chế theo sơ đồ 3.2 trong 10 ml CH2Cl2. Dung dịch mẫu có nồng độ:
c1 = 0,5mg/ml
Cho thuốc thử Salkowski vào ống nghiệm lắc đều để ổn định màu trong 15 phút. Đo A trên quang phổ kế UV so với mẫu trắng
A = 0,4232 – 0,1772 = 0,2460 (Phụ lục 7). Dựa vào đường chuẩn của salannin suy ra
52
Như thế trong 0,5 mg dung dịch mẫu có 0,0279 mg salannin. Do đó hàm lượng salannin trong chế phẩm là :
Hình 3.12: Máy UV Cary 50 dùng để đo hàm lượng salannin, ninbim và ARL.
53
a. Hình 3.13: Quy trình ly trích chọn lọc nimbin trong nhân hạt neem.
C33H36O9: tinh thể vàng nhạt, không mùi, vị đắng. λCĐ(95%MeOH): 210; 330nm (ε = 32.700;66)
Tan tốt trong ether, ether dầu, benzene, MeOH, tan khoảng 5% trong nước ở 25oC.
b. Định lượng nimbin với máy UV
Nimbin có cấu trúc limonoid nên tạo màu xanh lục với thuốc thử Salkowski. Do đó có thể dùng phương pháp so màu để đo hàm lượng nimbin ở λ = 577 nm trên quang phổ kế tử ngoại UV (Hình 3.11). Chất chuẩn nimbin 95% tinh khiết được nhập từ công ty Sigma Chemical (Đức).
Bột nhân hạt neem (1kg)
Cao benzene
- Hòa tan trong ether, lọc bỏ cặn.
- Rửa với 5% NaOH sau đó với nước và làm khan với Na2SO4.
- Thu hồi ether Cao ether
- Hòa tan trong hỗn hợp ether dầu-MeOH 80% - Thu hồi dung môi
Sản phẩm thô
- Sắc ký trên cột alumina AG II Spence H hạ hoạt (1kg), rửa giải với hỗn hợp ether dầu-benzene (1:1) - Thu hồi dung môi
- Kết tinh sản phẩm trong MeOH Chế phẩm
nimbin (64g)
- Trích trong bình cầu có ống sinh hàn hoàn lưu với 3l benzene trong 24 giờ ở nhiệt độ 50oC. - Thu hồi benzene
54
i. Xây dựng đường chuẩn theo định luật Beer-Lambert
Hòa tan 6 dung dịch chuẩn nimbin 95% trong CH2Cl2 nồng độ : 0,01 mg/ml, 0,02 mg/ml, 0,04 mg/ml, 0,06 mg/ml, 0,08 mg/ml và 0,1 mg/ml. Trong mỗi dung dịch cho vào thuốc thử Salkowski giống như trường hợp xây dựng đường chuẩn Salannin, dung dịch chuyển sang màu xanh lục.
Đo độ hấp thu A (absorbance) của 6 dung dịch này ở λ=577nm trên quang phổ kế tử ngoại, so với mẫu trắng. Vẽ đường chuẩn A=f(c) (Phụ lục 9a).
Đường chuẩn này có phương trình: y = 8,7014x + 0,0001
R2 = 0,9999
x là nồng độ C (g/ml) của nimbin y là độ hấp thu A ở = 577nm.
Dựa vào đường chuẩn này để suy ra nồng độ nimbin sau khi đo được độ hấp thu A của chế phẩm nimbin trong CH2Cl2.
ii. Định lượng nimbin
Hòa tan trong ống nghiệm 5mg chế phẩm nimbin trong 10ml CH2Cl2. Dung dịch mẫu có nồng độ :
c1= 0,5 mg/ml
Cho thuốc thừ Salkowski vào ống nghiệm, lắc đều để ổn định màu trong 15 phút. Do A trên quang phổ kế UV so với mẫu trắng.
A = A2 – A1
A = 0,4402 – 0,1772 = 0,2630 (Phụ lục 8) Dựa vào đường chuẩn của nimbin suy ra:
c2 = 0,0302 mg/ml
Như thế trong 0,5 mg mẫu có 0,0171 mg nimbin. Do đó hàm lượng nimbin trong chế phẩm là:
55
3.2.2. Điều chế chất làm bền ESO
3.2.2.1. Sự cần thiết điều chế chất làm bền
Khi phơi ngoài ánh nắng mặt trời, dưới tác dụng của ánh sáng tử ngoại các hoạt chất trong chế phẩm neem bị giảm cấp và dần dần mất tác dụng trong vòng 48 giờ. Một trong những chất mà các nhà hóa học sử dụng để tạo màng che, ngăn chặn ánh nắng mặt trời tác dụng vào chế phẩm neem làm giảm cấp hoạt chất của neem là một loại dầu đậu nành epoxy hóa ESO (Epoxydised Soybean Oil) còn gọi là dầu vernolic [47].
3.2.2.2. Quy trình điều chế chất làm bền ESO
a. Hình 3.14 : Quy trìnhđiều chế ESO.
Dầu đậu nành epoxy hóa (10,15kg)
Dầu đậu nành (10kg)
- Trung hòa với Na2CO3 5% đến pH=7. Rửa 3 lần với nước cất. Làm khan với MgSO4 - Lọc lấy dung dịch
- Sấy khô dưới áp suất thấp ở 50oC đến khi trọng lượng không thay đổi.
Hỗn hợp phản ứng epoxy hóa
- Cho 0,46kg formic acid vào 10kg dầu đậu nành trong bình phản ứng và khuấy đều 300 vòng/phút.
- Cho từ từ 3,82kg H2O2 nồng độ 45% vào bình phản ứng trong 2 giờ. Giữ phản ứng luôn luôn ở to 60oC.
- Tiếp tục khuấy thêm 6 – 10 giờ nữa đến khi phản ứng kết thúc.
56
b. Diễn giải quy trình
i. Tính chất và thành phần hóa học của dầu đậu nành
Dầu đậu nành là một loại dầu nữa khô, thuộc nhóm linoleic acid, tan ít trong cồn, tan nhiều trong các dung môi hữu cơ như ether dầu, hexane, chloroform. Xác định các thành phần hóa học của dầu đậu nành, kết quả như sau: (Bảng 3.8).
Bảng 3.8: Thành phần hóa học của dầu đậu nành.
TT Tên thông thƣờng Dđ (oC) Đs (oC/mmHg) Hàm lƣợng 1 Palmitic acid 63 167/1 7 – 11 2 Stearic acid 69,6 184/4 2 – 6 3 Oleic acid 16,3 153/0,1 21 – 23 4 Linoleic acid -5 202/1,4 51 – 56 5 Linolenic acid -11 158/0,001 9 – 11 Acid béo bão hòa: 9 – 17%
Acid béo bất bão hòa: 81 – 90%
ii. Phản ứng epoxy hóa
Dầu đậu nành có chứa oleic acid (C18:1), linoleic acid (C18:2) và linolenic acid (C18:3) có thể chuyển thành dẫn xuất epoxy (oxirane) với các tác nhân oxy hóa nhẹ như peracid RCO3H hoặc hỗn hợp H2O2–RCO2H (tạo ra peracid in situ) và sau đó thủy giải cho ra một glycol.
Do phần lớn peracid không bền nên trong công nghiệp người ta thường sử dụng phương pháp “in situ” gồm 3 giai đoạn liên tiếp xảy ra:
Phản ứng tạo thành peracid do tác dụng của H2O2và acid tương ứng, giai đoạn này chậm và thu nhiệt.
Phản ứng epoxy hóa trên nối đôi, giai đoạn này nhanh và tỏa nhiệt. Thông thường người ta epoxy hóa dầu đậu nành bằng peracetic acid hay performic acid.
Trung hòa hỗn hợp phản ứng đến pH = 7.
Trong đề tài này chúng tôi dùng performic acid “insitu” để epoxy hóa dầu đậu nành ở nhiệt độ 50-60oC theo Hình 3.14.
57
3.2.2.3. Tính chất của dầu ESO điều chế
a. Tính chất vật lý
Dầu ESO có màu vàng sánh
Đo các tính chất vật lý của dầu ESO: Tỷ trọng : 0,985 – 0,995 Chiết xuất : 1,470 – 1,472
Tính hòa tan: không tan trong nước, tan kém trong ethanol, hydrocarbone mạch thẳng, tan tốt trong hydrocarbon thơm.
b. Xác định chỉ số epoxy
Chỉ số epoxy của dầu béo được biểu diễn bằng đương lượng epoxy Eđl tức trọng lượng dầu béo tính bằng g có chứa 1 nhóm epoxy.
Nguyên tắc:
Thực hiện phản ứng mở vòng epoxy của dầu ESO bằng lượng thừa chlorhydrat pyridine trong pyridine, sau đó định phân lượng chlorhydrat pyridine dư bằng dung dịch NaOH 0,1N với thuốc thử phenolphtaleine 1%.
Thực hiện thí nghiệm có mẫu tức dầu đậu nành đã được epoxy hóa và thí nghiệm không mẫu (mẫu trắng) tức dầu đậu nành không epoxy hóa trong điều kiện nêu trên.
Đương lượng epoxy được xác định bởi công thức:
Trong đó:
V1: thể tích dd NaOH dùng để định phân trong thí nghiệm không mẫu (ml). V2: thể tích dd NaOH dùng để định phân trong thí nghiệm có mẫu (ml). N: nồng độ dd NaOH bằng 0,1 W: trọng lượng mẫu (g) Kết quả: W: 1g V1: 76ml V2: 32ml Vậy:
58
Dầu đậu nành có trọng lượng phân tử khoảng: M = 878 – 885 Như thế trong phân tử dầu đậu nành có khoảng 3,88 nhóm epoxy. Hàm lượng oxiran (Ox) trong dầu ESO:
Theo ASTM của Mỹ hàm lượng Ox% ≥ 6,0
Như thế dầu ESO đạt điêu chuẩn chất lượng ASTM của Mỹ.
3.2.3. Điều chế chất tạo nhũ sucroester 3.1.3.1. Quy trình điều chế sucroester. 3.1.3.1. Quy trình điều chế sucroester.
Có nhiều phương pháp được sử dụng để điều chế sucroester. Theo phương pháp hóa học, phản ứng giữa sucrose và ester ethyl acid béo xảy ra ở nhiệt độ khoảng 165oC với xúc tác kiềm, thường là K2CO3 trong dung môi DMSO hay DMF. Sản phẩm là một hỗn hợp mono và diesterdo không kiểm soát được tiến trình phản ứng và hiệu suất thường rất thấp, khoảng 20-30%. Gần đây người ta điều chế sucroester với xúc tác enzyme, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ khoảng 40oC, hiệu suất có thể lên đến 75-80% [48].
Trong đề tài này chúng tôi dùng enzyme lipase làm xúc tác phản ứng xuyên ester hóa giữa sucrose và ethyl laurateđiều chế từ dầu dừa để điều chế sucroester.
59
Hình 3.15: Quy trình điều chế sucroester.
b. Diễn giải quy trình công nghệ
i. Xúc tác lipase
Enzym lipase tên thuơng mại Lipolase 100M và 100T hấp thu trên chất mang rắn SiO2 dạng hạt do vi khuẩnThermomyces lanuginosus sinh tổng hợp. Enzyme này được nhập từ hãng Novozyms A/S (Đan Mạch).
Sucrose (2,06kg, 6mol)
- Lọc hỗn hợp phản ứng, loại bỏ cặn.
- Chưng cất dưới áp suất thấp thu hồi dung môi butanol.
- Trích với hexane để thu hồi ethyl laurate.
- Trích tiếp hỗn hợp phản ứng còn lại với một lượng gấp đôi (v/v) hỗn hợp dung môi cyclohexane/butanol 1:1 (v/v).
- Chưng cất dưới áp suất thấp thu hồi dung môi. - Sắc ký cột với silicagel 60 H Merck dung ly gradient CHCl3/EtOH (từ 20:1 đến 1:1) tách ra 2 chất A và B.
- Kiểm tra A và B với thuốc thử Bial để xác định A và B là 2 sucroester.
- Đo chỉ số OH cùng với chỉ số xà phòng hóa của A và B để phân biệt 2 chất mono và di-sucroester. Hỗn hợp
phản ứng ester hóa
- Hòa tan sucrose trong 20l butanol.
- Cho vào 10g lipase hoạt độ 4,5 – 18 μkat. Khuấy trong 30 min ở 40oC.
- Cho tiếp vào 1,56kg (6mol) ethyl laurate khan. - Theo dõi phản ứng với TLC Kieselgel 60; phản ứng kết thúc sau 20 giờ.
60
Hỗn hợp mono và di-sucroester
60
ii. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
TLC được thực hiện với bản mỏng silica gel 60 Merck, dung ly CHCl3/MeOH 4:1 (v/v). Các vết sucroester được phát hiện bằng cách nhúng bản mỏng trong dung dịch thuốc thử Bial (orcinol/FeCl3 pha trong ethanol). Sấy khô với không khí nóng đến 120oC trong 5 phút, sucroester hiện ra dạng vết tròn màu nâu sậm [49].
iii. Tách các sucroester
Sắc ký cột silica gel với dung ly CHCl3/EtOH tách ra 2 chất sucroester A và B. Để phân biệt A và B cần xác định chỉ số hydroxyl và chỉ số xà phòng hóa của A và B.
Chỉ số hydroxyl của một chất được biểu diễn bằng số nhóm OH có chứa trong 100g chất đó nên mono-sucroester có chỉ số hydroxyl lớn hơn di-sucroester.
Chỉ số xà phòng hóa của một chất là số mg KOH cần thiết để xà phòng hóa các thành phần có thể bị xà phòng hóa chứa trong 1g chất đó. Do đómono-sucroester có chỉ số xà phòng hóa thấp hơn di-sucroester.
Xác định chỉ số hydroxyl của A và B bằng cách acetyl hóa A và B với lượng thừa anhydrid acetic xúc tác pyridine, sau đó thủy giải anhydrid acetic dư và định phân acetic