1.4.1. Sự nhiễm bẩn và mất chất phân tích
Khi nghiên cứu phân tích vết, phải thường xuyên chú ý đến độ sạch của dụng cụ, nước cất, hóa chất, môi trường nơi làm việc và đặt máy đo,... nhằm loại trừ tới mức thấp nhất những nguyên nhân gây nhiễm bẩn hoặc làm mất chất phân tích, gây ra sai số hệ thống và nhiều khi mắc sai số nghiêm trọng. Sự nhiễm bẩn và mất chất phân tích cũng có thể phát sinh trong quá trình chuẩn bị mẫu cho phân tích, chẳng hạn khi xử lý mẫu: lọc, axit hóa, kiềm hóa, tách chiết, kết tủa,... hay phân huỷ mẫu bằng các hỗn hợp axit, tro hóa khô,... Vì vậy, cần hạn chế tới mức tối đa việc đưa nhiều hóa chất vào mẫu trong giai đoạn chuẩn bị mẫu cho phân tích.
1.4.2. Thí nghiệm trắng
Trong phân tích vết, do sự nhiễm bẩn thường xảy ra, nên để kiểm tra mức nhiễm bẩn của toàn bộ hệ thống phân tích (hệ thống phân tích ở đây bao gồm: các hóa chất, dụng cụ và máy móc được sử dụng, kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích, phương pháp phân tích,...), bắt buộc phải tiến hành song song thí nghiệm trắng. Thí nghiệm trắng là thí nghiệm được tiến hành hoàn toàn tương tự (từ khâu đầu đến khâu cuối) như khi phân tích mẫu thật, nhưng ở đây là thực hiện trên mẫu trắng - là mẫu được chuẩn bị sao cho có thành phần
giống với mẫu thật, nhưng không chứa chất phân tích. Từ đó, tiến hành hiệu chỉnh kết quả phân tích bằng cách trừ đi kết quả thu được từ thí nghiệm trắng.
1.4.3. Các yếu tố đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
Khi nghiên cứu phát triển một phương pháp phân tích, nhất thiết phải đánh giá độ tin cậy của nó. Các yếu tố đánh giá độ tin cậy của một phương pháp phân tích bao gồm: độ lặp lại và độ hồi phục, độ đúng, độ nhạy và GHPH,...
1.4.3.1. Độ lặp lại và độ hồi phục
Độ lặp lại (repeatability) và Độ hồi phục (reproducibility), một cách tương ứng, là độ sai lệch giữa các giá trị riêng lẻ (xi) và giá trị trung bình (x) xác định được trong những điều kiện (người phân tích, phương pháp phân tích, thời gian, thiết bị và hóa chất,...) giống nhau và không giống nhau. Độ lặp lại và độ hồi phục đều được xác định qua Độ lệch chuẩn hoặc Độ lệch chuẩn tương đối (hay Hệ số biến động). Như vậy, khi độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD) càng lớn, thì sai số của phương pháp phân tích càng lớn [74].
Khi đánh giá kết quả phân tích của nhiều phòng thí nghiệm tham gia các Kỳ thi Quốc tế về Khả năng Phân tích (kiểu collaborative testing) trong 10 năm liền, Thampson M. [103] đã thiết lập được mối quan hệ hàm số (được gọi là hàm Horwitz) giữa RSD của phương pháp phân tích và nồng độ hay hàm lượng chất phân tích (C): RSD (%) = 2(1 - 0,5lgC). Đồ thị biểu diễn quan hệ đó có dạng kèn Trumpet: khi C càng nhỏ, RSD càng lớn (hay càng loe ra như miệng kèn Trumpet) và khi C = 0,5 1 ppb, thì RSD của phương pháp phân tích khoảng 65 45%.
1.4.3.2. Độ đúng
Độ đúng (accuracy) là độ gần sát giữa kết quả xác định được (x) và giá trị thực () của nó. Giá trị của một chất phân tích được chấp nhận là giá trị
thông báo trong Chứng chỉ đi kèm với Vật liệu So sánh (Certified Reference Material - CRM). Các mẫu chuẩn (hay mẫu CRM) được cung cấp bởi đơn vị chế tạo - thường là một số tổ chức quốc tế nổi tiếng như Community Bureau of Reference (BCR), National Institute of Standards & Technology (NIST), Laboratory of the Government Chemist (LGC), Institute of Geophysical and Geochemical Exploration (IGGE),... Độ đúng của phương pháp phân tích được đánh giá thông qua việc phân tích mẫu chuẩn. Phương pháp phân tích có độ đúng tốt khi kết quả xác định được (x) nằm trong khoảng tin cậy của giá trị thực ( ± ) ( được thông báo kèm theo trong chứng chỉ của mẫu chuẩn); hoặc có thể so sánh kết quả xác định được (x) với giá trị thực () theo chuẩn Student: t = x . n
S
.
Trong trường hợp không có mẫu chuẩn, có thể đánh giá độ đúng thông qua việc phân tích mẫu thêm chuẩn (spiked sample), rồi tính độ thu hồi (recovery, ký hiệu là Rev): Rev = lượng tìm thấy . 100 / (lượng thêm vào + lượng có sẵn trong mẫu). Rev càng gần 100%, phương pháp càng đạt được độ đúng tốt.
Ngoài ra, độ đúng của phương pháp phân tích có thể được đánh giá thông qua việc so sánh phương pháp phân tích đã nghiên cứu với phương pháp chuẩn khác bằng phương pháp thống kê kiểm tra cặp (paired test) [74], tức là so sánh kết quả thu được từ 2 phương pháp phân tích, bao gồm các bước sau:
+ Xác định di = xi - yi; trong đó di là độ lệch, xi là các kết quả xác định theo phương pháp thứ nhất, yi là các kết quả xác định theo phương pháp thứ hai, i = 1 n (n là số mẫu thí nghiệm).
+ Tính độ lệch trung bình: di
d = n
+ Tính độ lệch chuẩn của các giá trị riêng lẻ di: i 2 d (d d) S = n - 1 + Tính tTính = d d 0 . n S
(0 là giá trị thực của d , tức là không có sai lệch giữa kết quả của hai phương pháp phân tích)
+ So sánh tTính với t (p = 0,05; f = n - 1), f là bậc tự do. Nếu tTính < t (p = 0,05; f = n - 1) thì kết quả xác định theo 2 phương pháp không khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa p = 0,05 và ngược lại.
1.4.3.3. Độ nhạy
Một cách tổng quát, độ nhạy của phương pháp phân tích được xác định bởi độ biến thiên của tín hiệu đo (y) khi có biến thiên của thông số kích thích, chẳng hạn nồng độ của chất phân tích (C), hoặc pH, nhiệt độ,... Như vậy, độ nhạy chính là độ dốc (hay tang góc nghiêng) của đường chuẩn. Nếu phương trình đường chuẩn có dạng y = a + bC, thì độ nhạy = y / C = b. Riêng trong phương pháp quang phổ hấp thụ (phân tử hoặc nguyên tử), độ nhạy được định nghĩa khác [107].
1.4.3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (GHPH) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích tạo ra được một tín hiệu có thể phân biệt một cách tin cậy với tín hiệu trắng (hay tín hiệu nền) [75]. Với ý nghĩa - có thể phân biệt một cách tin cậy - đã có nhiều quan điểm khác nhau và do đó cũng có nhiều cách xác định GHPH khác nhau, chẳng hạn: xác định theo quy định của IUPAC - “quy tắc 3” [75], hoặc theo Cơ quan Bảo vệ Môi trường của Mỹ (EPA), hoặc theo Pallesen [74],...
Phổ biến nhất hiện nay vẫn là cách xác định GHPH theo “quy tắc 3”. Theo quy tắc này, GHPH được tính như sau [75]:
Trong đó, y là GHPH hoặc tín hiệu ứng với GHPH (biết tín hiệu y sẽ tính được GHPH từ phương trình đường chuẩn: y = a + bC GHPH = C = [y - a] / b); yb là nồng độ hoặc tín hiệu mẫu trắng; b (hay Sb) là độ lệch chuẩn của nồng độ hoặc tín hiệu mẫu trắng.
Có thể xác định yb và Sb theo 2 cách:
Cách 1: Tiến hành n thí nghiệm để xác định nồng độ mẫu trắng, thu được các giá trị ybi (i = 1 n). Từ đó tính yb và Sb theo các công thức sau:
i b b y y n (1.6) và i 2 b b b (y y ) S n - 1 (1.7)
Sau đó tính GHPH theo (1.5). Việc xác định yb và Sb như vậy sẽ tốn nhiều thời gian. Để giảm số lượng thí nghiệm và tính nhanh GHPH, có thể tiến hành theo cách 2.
Cách 2: Tiến hành thí nghiệm để thiết lập phương trình đường chuẩn y = a + bC. Từ đó xác định yb và Sb bằng cách: chấp nhận yb (tín hiệu mẫu trắng) là giá trị của y khi C = 0 yb = a và Sb = Sy (độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn):
2 i i b y (y - Y ) S S n 2 (1.8)
Ở đây, yi là các giá trị thực nghiệm của y; Yi là các giá trị tính từ phương trình đường chuẩn của y.
Sau đó, tính tín hiệu ứng với GHPH theo (1.5): y = yb + 3Sb = a + 3Sy. Thay y vào phương trình đường chuẩn, biến đổi sẽ được công thức tính GHPH như sau:
y
3S GHPH =
Giới hạn định lượng (GHĐL) là tín hiệu hay nồng độ thấp nhất trên một đường chuẩn tin cậy và thường người ta chấp nhận GHĐL = 10Sb [75], nghĩa là: GHĐL = (3 4) GHPH.
1.5. KẾT LUẬN CHUNG
Từ tổng quan tài liệu cho thấy: việc xác định Pb và Cd, đặc biệt là xác định đồng thời chúng - hai kim loại độc thường có mặt trong các đối tượng môi trường, sinh hóa và dược phẩm - là rất cần thiết.
Để xác định trực tiếp (tức là không cần chiết, tách hoặc cô mẫu) những lượng vết và siêu vết của Pb và Cd trong các đối tượng môi trường, sinh hóa và dược phẩm, việc lựa chọn phương pháp ASV là hoàn toàn đúng đắn. Song, cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu xác định Pb và Cd theo phương pháp ASV đều sử dụng điện cực làm việc là HMDE và MFE. Các điện cực thủy ngân (HMDE và MFE) gây lo lắng về môi trường nên không cho phép ứng dụng trong các thiết bị phân tích tại hiện trường (hay phân tích online). Nếu phát triển được điện cực màng bitmut (bitmut là một kim loại không độc) để phân tích lượng vết Pb và Cd bằng phương pháp ASV thì không chỉ giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường mà còn tạo tiền đề cho sự phát triển các kỹ thuật phân tích tại hiện trường, vì có thể thải bỏ bitmut ra môi trường. Mặt khác, điện cực BiFE dễ chế tạo nên nếu thành công, thì khi áp dụng sẽ có tính khả thi cao ở điều kiện các phòng thí nghiệm trong nước hiện nay.
Việc xác định trực tiếp và đồng thời lượng vết Pb và Cd theo phương pháp ASV, mà không cần giai đoạn làm giàu trước như chiết, cộng kết, tách sắc ký,... sẽ góp phần làm giảm nguy cơ gây nhiễm bẩn hoặc mất chất phân tích. Tuy vậy, để loại trừ tối đa những nguy cơ đó nhằm nâng cao độ nhạy và hạ thấp GHPH của phương pháp, nhất thiết phải có môi trường phòng thí nghiệm sạch và sử dụng các hóa chất siêu sạch trong quá trình phân tích. Điều này cũng là một trở ngại đối với nhiều phòng thí nghiệm trong nước. Như
vậy, khi xây dựng một quy trình phân tích vết sao cho có tính khả thi cao ở trong nước, có thể phải chấp nhận giải pháp dung hòa: không yêu cầu phải đạt được GHPH rất thấp (cỡ 10-9 M) để khỏi phải đòi hỏi quá cao về độ tinh khiết của hóa chất và độ sạch của phòng thí nghiệm, song vẫn phải đảm bảo độ tin cậy của những kết quả thu được.
Phương pháp ASV dùng điện cực BiFE là một phương pháp mới phát triển ở nước ta và trên thế giới, nên các vấn đề về lý thuyết và thực nghiệm của phương pháp này, cần được tiếp tục nghiên cứu bổ sung. Mặt khác, việc xây dựng quy trình phân tích đồng thời lượng vết Pb và Cd cũng là một trong những đòi hỏi cấp thiết cho những nghiên cứu liên quan đến độc học và môi trường. Rõ ràng, nghiên cứu áp dụng phương pháp ASV với điện cực BiFE để xác định lượng vết Pb và Cd là một vấn đề thời sự và đây cũng là nghiên cứu đầu tiên ở nước ta. Nghiên cứu này sẽ góp phần mở ra một hướng đi mới trong việc giải quyết những đòi hỏi cấp bách của các phương pháp phân tích điện hóa hiện đại trong lĩnh vực phân tích vết.
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Trong luận án này, chúng tôi nghiên cứu phát triển và ứng dụng điện cực BiFE để xác định lượng vết Pb và Cd bằng phương pháp ASV. Mục đích cuối cùng là phải xây dựng được quy trình phân tích lượng vết Pb và Cd trong các đối tượng môi trường (trầm tích, đất, nước tự nhiên), và các loại mẫu khác như sinh hóa (máu, nước tiểu), dược phẩm. Để giải quyết những nhiệm vụ đó, trước hết cần khảo sát để tìm các điều kiện thí nghiệm thích hợp nhằm phân tích chính xác Pb và Cd bằng phương pháp ASV dùng điện cực BiFE. Các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau:
(1). Nghiên cứu xác định Pb và Cd trên điện cực BiFE bằng phương pháp ASV:
- Khảo sát đường von-ampe vòng để tìm hiểu đặc tính von-ampe hòa tan của Pb và Cd trên điện cực BiFE.
- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến tín hiệu hòa tan của Pb và Cd: + Kiểu điện cực làm việc (BiFE in situ và BiFE ex situ);
+ Thành phần nền, nồng độ BiIII để tạo điện cực làm việc, thế và thời gian điện phân làm giàu, tốc độ quay điện cực, tốc độ quét thế;
+ Kỹ thuật ghi tín hiệu hòa tan: von-ampe xung vi phân (DP), von- ampe sóng vuông (SQW);
+ Ảnh hưởng của các chất cản trở gồm: oxy hòa tan, anion; cation kim loại và chất hoạt động bề mặt.
- Đánh giá độ tin cậy của phương pháp bao gồm: độ lặp lại, độ nhạy, GHPH và khoảng tuyến tính.
(2). Áp dụng thực tế và xây dựng quy trình phân tích:
(mẫu vật liệu so sánh được cấp chứng chỉ - CRM).
- Áp dụng phương pháp ASV dùng điện cực BiFE để phân tích Pb và Cd trong một số mẫu thực tế (mẫu môi trường, sinh hóa và dược phẩm).
- Trên cơ sở các kết quả áp dụng thực tế, xây dựng quy trình phân tích Pb và Cd trên điện cực BiFE bằng phương pháp ASV (bao gồm cả kỹ thuật xử lý mẫu).
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Tiến trình thí nghiệm 2.2.1. Tiến trình thí nghiệm
Ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát được đánh giá qua ảnh hưởng của chúng đến tín hiệu hòa tan (Ep và Ip) của Pb và Cd (gọi chung là Me). Qua đó, đánh giá ảnh hưởng của chúng đến độ lặp lại, độ nhạy, GHPH của các phép đo và của phương pháp phân tích. Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện ở nhiệt độ phòng, thường là 25oC. Nói chung, trong mọi trường hợp, bố trí thí nghiệm đều theo trình tự dưới đây.
2.2.1.1. Chuẩn bị điện cực làm việc - điện cực BiFE
Điện cực BiFE được chế tạo theo hai cách: in situ và ex situ.
Điện cực BiFE in situ được chuẩn bị bằng cách thêm BiIII trực tiếp vào dung dịch chứa nền đệm và MeII, Bi được kết tủa đồng thời cùng với Me trên điện cực làm việc là điện cực đĩa than thuỷ tinh trong giai đoạn điện phân làm giàu ở thế và thời gian xác định.
Trong trường hợp khảo sát lựa chọn kiểu điện cực làm việc, để chuẩn bị điện cực BiFE ex situ, tiến hành điện phân dung dịch BiIII có nồng độ thích hợp trong nền đệm thích hợp ở thế điện phân (Edep) và thời gian điện phân (tdep) như khi chuẩn bị kiểu điện cực BiFE in situ ở trên. Sau đó tia rửa cực cẩn thận bằng nước sạch và như vậy điện cực BiFE ex situ đã sẵn sàng để dùng. Sau một loạt phép đo (thường từ 10 15 phép đo), khi cần tạo điện cực BiFE ex situ mới, thì cho điện cực quay và dùng giấy lọc mềm để chùi sạch
và đánh bóng bề mặt điện cực, rồi tia rửa bằng nước sạch và lặp lại quá trình chuẩn bị điện cực BiFE ex situ theo cách như trên.
2.2.1.2. Ghi đường von-ampe hòa tan
Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu chứa nền đệm và MeII, rồi cho vào bình điện phân chứa 3 điện cực: điện cực làm việc BiFE ex situ hoặc in situ (khi dùng điện cực BiFE in situ, phải thêm BiIII vào dung dịch nghiên cứu), điện cực so sánh Ag/AgCl/KCl 3M và điện cực phụ trợ Pt. Tiến hành làm giàu bằng cách điện phân kết tủa Me lên bề mặt điện cực BiFE ex situ (hoặc kết tủa đồng thời Me và Bi lên bề mặt điện cực đĩa than thuỷ tinh trong trường hợp dùng điện cực BiFE in situ) ở thế xác định (Edep) (âm hơn thế khử của Me) trong khoảng thời gian xác định (tdep). Lúc này, điện cực làm việc quay với tốc độ không đổi. Kết thúc giai đoạn làm giàu, ngừng quay điện cực 15 s. Tiếp theo, quét thế anot từ Edep đến –300 mV (khi dùng BiFE ex situ) hoặc +300 mV (khi dùng BiFE in situ), đồng thời ghi đường von-ampe hòa tan bằng kỹ thuật DP hoặc SQW với các thông số kỹ thuật thích hợp.
Khi dùng điện cực BiFE in situ, để phép đo có độ lặp lại tốt, cần tiến hành làm sạch bề mặt điện cực làm việc trước mỗi phép đo bằng cách áp lên điện cực làm việc một thế khá dương, khoảng +300 mV (Eclean) trong thời gian 10 30 s (tclean) để hòa tan Bi và vết Me còn bám trên bề mặt điện cực làm việc. Sau đó, thêm chất chuẩn vào, lại cho quay điện cực làm việc để