2.2.1. Nghiờn cứu thực nghiệm
2.2.1.1. Nghiờn cứu tỏc dụng của CNTT đối với cơ trơn
Thỏ chủng New Zealand White, giống cỏi, trọng lượng 2,5 - 3,5kg được xỏc nhận cú thai từ 8-10 ngày (cú thai ở giai đoạn 1 của thai kỳ) do Trung tõm chăn nuụi - Viện Kiểm nghiệm cung cấp.
Thỏ được nuụi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống trong 7 ngày trước khi thụ thai đến hết thời gian nghiờn cứu.
* Hoỏ chất và mỏy múc phục vụ nghiờn cứu
- Dung dịch Ringer nuụi tai thỏ, dung dịch Tyrod nuụi tử cung và ruột thỏ cụ lập.
- Oxytocin tổng hợp, dạng ống tiờm, mỗi ống 1 ml chứa 5 đơn vị quốc tế (UI) của Hóng Umedica - Ấn độ. Nồng độ oxytocin dựng trong nghiờn cứu là: 1,2 ml dung dịch 0,05 UI/1ml được trộn trong 10 ml Tyrod vừa đủ [87].
- Mỏy nuụi cơ quan cụ lập cú gắn hệ thống ổn định nhiệt độ và bộ ghi, mó số 4050 Two Isolated Organ Chamber Bath của Hóng Ugo- Baisil, Italy.
- Hệ thống bỡnh thủy tinh và dõy truyền dựng trong đỏnh giỏ tỏc dụng trờn trương lực mạch tai thỏ.
2.2.1.2. Nghiờn cứu tỏc dụng của CNTT đối với quỏ trỡnh cầm mỏu
- Thỏ chủng New Zealand White, cả 2 giống, trọng lượng 1,8 – 2,5 kg do Trung tõm chăn nuụi - Viện Kiểm nghiệm cung cấp.
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 18-22g do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp.
Động vật thớ nghiệm được nuụi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống trong 7 ngày trước khi nghiờn cứu đến hết thời gian nghiờn cứu.
* Hoỏ chất và mỏy múc phục vụ nghiờn cứu
- Dung dịch xột nghiệm mỏu ABX Minidil LMG của hóng ABX - Diagnostics, định lượng trong mỏy Vet abcTM Animal Blood Counter.
- Sintrom (Acenocoumarol) viờn nộn 4 mg của Hóng Novartis. Thuốc cú tỏc dụng chống đụng mỏu thụng qua việc ngăn chặn một phần sử dụng lại vitamin K trong gan. Trong cơ thể, vitamin K cần thiết để tham gia tổng hợp một số yếu tố đụng mỏu (yếu tố II, VII và X) giỳp trỏnh chảy mỏu. Nồng độ sintrom thớch hợp gõy chảy mỏu là 0,5mg/kg.
- Mỏy xột nghiệm CA 1500 của Hóng Sysmex (Nhật Bản), khoa Huyết học, bệnh viện Bạch Mai.
2.2.2. Nghiờn cứu lõm sàng
Thử nghiệm lõm sàng tiến hành đối với người bệnh cú thai từ 5-22 tuần, được chẩn đoỏn là dọa sẩy thai, nằm điều trị nội trỳ tại khoa Phụ sản bệnh viện Đa khoa YHCT Hà Nội và khoa Phụ II bệnh viện Phụ sản Trung ương.
2.2.2.1. Cỡ mẫu nghiờn cứu
Cụng thức tớnh cỡ mẫu như sau:
n1 = n2 = Z2 (α,β) x = P1 (1 - P1) + P2 (1-P2) (P1 - P2)2
Trong đú n1 = n2: Cỡ mẫu nghiờn cứu cần cú P1; P2 : Tỷ lệ khỏi của nhúm 1 và 2
P1 - P2: Khoảng sai lệch mong muốn giữa 2 nhúm α : Mức ý nghĩa thống kờ
β : Mức sai lầm loại 2 cho phộp
Z2(α,β): Giỏ trị Z thu được từ bảng Z ứng với giỏ trị - Tớnh cỡ mẫu:
Thay vào cụng thức tớnh:
n1 = n2 = 3,8 x 0,86(1 - 0,86) + 0,70 (1 - 0,70) = 49 (0,86 - 0,70)2
Như vậy, cỡ mẫu nghiờn cứu của mỗi nhúm là n1 = n2 = 50 đối tượng. Trong thực tế sẽ phải lấy số lượng đối tượng nghiờn cứu cao hơn để đề phũng trong quỏ trỡnh nghiờn cứu phải loại trừ tiếp một số đối tượng do khụng thực hiện được đỳng theo yờu cầu của nghiờn cứu.
2.2.2.2. Tiờu chuẩn chọn đối tượng nghiờn cứu
Thai phụ được chẩn đoỏn là dọa sảy thai (theo YHHĐ) và thai động bất an (theo YHCT), khụng phõn biệt nghề nghiệp, tự nguyện tham gia nghiờn cứu.
Cỏc thai phụ thuộc diện nghiờn cứu được khỏm tỉ mỉ bởi bỏc sỹ chuyờn khoa Phụ sản, được làm cỏc xột nghiệm (CTM, sinh hoỏ mỏu, định lượng
βHCG mỏu), siờu õm thai tại khoa Xột nghiệm và khoa Chẩn đoỏn hỡnh ảnh của bệnh viện Đa khoa YHCT Hà Nội và bệnh viện Phụ sản trung ương, được theo dừi theo một mẫu bệnh ỏn thống nhất. Tất cả cỏc thai phụ này đều được điều trị nội trỳ tại bệnh viện.
* Tiờu chuẩn chẩn đoỏn YHHĐ (theo Hướng dẫn chuẩn quốc gia về cỏc dịch vụ chăm súc sức khỏe sinh sản 2007) [6]
- Cú thai: Chậm kinh, Test HCG (+) (quick (+)). - Hoặc ra mỏu AĐ và/hoặc đau bụng dưới.
- Khỏm CTC cũn dài, đúng kớn, TC to tương ứng tuổi thai.
- Siờu õm cú tỳi ối trong BTC (cú thể cú õm vang thai và/hoặc tim thai).
* Tiờu chuẩn chẩn đoỏn YHCT (theo Bệnh học Ngoại - Phụ YHCT) [44]
Trờn cơ sở nhọ̃n đụ́i tượng nghiờn cứu theo tiờu chuõ̉n chõ̉n đoán của YHHĐ, thụng qua tứ chõ̉n đờ̉ sắp xờ́p, phõn loại triợ̀u chứng đờ̉ đánh giá sự thay đụ̉i của các triợ̀u chứng này sau điờ̀u trị.
2.2.2.3. Tiờu chuẩn loại trừ
- Dọa sẩy thai do nguyờn nhõn thực thể như: U xơ tử cung, hở eo tử cung.
- Thai phụ mắc cỏc bệnh mạn tớnh như: tăng HA, bệnh lý tim mạch, đỏi thỏo đường, Basedow, HIV/AIDS.
- Thai phụ khụng dựng thuốc theo đỳng phỏc đồ điều trị.
- Thai phụ tự ý dựng thờm cỏc thuốc khỏc trong thời gian điều trị. - Thai phụ khụng làm đủ cỏc xột nghiệm theo yờu cầu của nghiờn cứu.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.3.1. Nghiờn cứu thực nghiệm
2.3.1.1. Nghiờn cứu tỏc dụng của CNTT đối với cơ trơn
- Nghiờn cứu được tiến hành đồng thời trờn cả 3 nhúm cơ trơn: tử cung, mạch mỏu và ruột cụ lập của thỏ cú thai.
- Xỏc định liều dựng cho thỏ: cỏc loài động vật khỏc nhau cú dược động học khỏc nhau. Theo WHO và cỏc nghiờn cứu trờn sỳc vật hướng dẫn cỏch quy đổi liều dựng từ người sang động vật như sau [18]:
Chuột nhắt: 10-12 lần liều dựng của người. Chuột cống: 7-8 lần liều dựng của người. Thỏ: 3-4 lần liều dựng của người. Chú: 1-2 lần liều dựng của người.
Như vậy, động vật càng nhỏ thỡ hệ số càng lớn. Nghiờn cứu này chọn thỏ, liều quy đổi gấp 3 lần liều dựng của người. Thuốc NC dựng với liều 100ml/24h, cơ thể người trung bỡnh cú 5 lớt mỏu. Từ đú suy ra nồng độ thuốc NC trong mỏu sẽ tương đương 2%. Quy đổi sang liều dựng của thỏ tương đương liều dựng trờn lõm sàng sẽ là 6%.
- Trong NC này, thuốc NC được thử tỏc dụng ở 3 liều: tương đương liều dựng trờn lõm sàng, ẵ liều dựng trờn lõm sàng và gấp 1,5 lần liều dựng trờn lõm sàng. Liều dựng tương ứng trờn thỏ sẽ là CNTT nồng độ 3%, 6% và 9%.
* Tỏc dụng của cao nước “Thọ thai” trờn cơ trơn tử cung thỏ cú thai cụ lập
Tử cung thỏ cú thai giai đoạn 1 được cụ lập và nuụi trong bỡnh chứa 10ml dung dịch Tyrod theo phương phỏp của Nimomiya [87]. Bỡnh nuụi tử cung cụ lập luụn được duy trỡ ở nhiệt độ 370C.Chọn những tử cung thỏ cú ớt nhất 1 cơn co trong 10 phỳt vào nghiờn cứu. Tử cung thỏ cú dạng tử cung hai sừng đổ chung vào một ống cổ tử cung. Mỗi sừng tử cung lấy một mẫu dài khoảng 1,5-2cm.
- Bước 1: Ghi co búp tử cung thỏ cú thai bỡnh thường trong thời gian tối thiểu từ 15-30 phỳt.
- Bước 2: Nhỏ 1,2 ml dung dịch oxytocin nồng độ 0,05 UI/ml. Ghi co búp tử cung sau khi nhỏ oxytocin trong thời gian tối thiểu từ 15-30 phỳt.
- Bước 3: Thay 10 ml dung dịch tyrod nuụi tử cung, nhỏ CNTT ở cỏc nồng độ khỏc nhau 3%, 6% và 9%. Ghi co búp tử cung sau khi nhỏ CNTT trong thời gian tối thiểu từ 15-30 phỳt.
- Xỏc định số cơn co tử cung trong thời gian 30 phỳt ở mỗi bước trờn. Xỏc định biờn độ trung bỡnh, biờn độ cao nhất và thấp nhất của cỏc cơn co tử cung trong mỗi bước trờn.
* Tỏc dụng của cao nước “Thọ thai” trờn cơ trơn thành mạch tai thỏ cú thai cụ lập - Tai thỏ được cụ lập theo phương phỏp Kravkov. Lần lượt truyền dung dịch Ringer khụng pha thuốc NC và cú pha thuốc thử theo 3 nồng độ khỏc nhau (3%, 6% và 9%) ở độ cao 100cm vào động mạch giữa tai thỏ.
- Đếm số giọt dung dịch chảy ra ở 2 tĩnh mạch rỡa tai thỏ trước và sau khi truyền thuốc thử trong thời gian 1 phỳt. Nếu sau khi dựng thuốc NC, số giọt chảy ra ở 2 tĩnh mạch rỡa tai tăng lờn, chứng tỏ mạch gión hoặc ngược lại, nếu số giọt giảm đi chứng tỏ mạch co.
* Tỏc dụng của cao nước “Thọ thai” trờn cơ trơn ruột thỏ cú thai cụ lập
- Ruột thỏ đoạn hồi tràng dài 2 cm được cụ lập và nuụi trong bỡnh chứa 10ml dung dịch Tyrod.
- Ghi nhu động ruột thỏ trong điều kiện bỡnh thường. Sau đú nhỏ CNTT ở 3 nồng độ 3%, 6% và 9% trong 10 ml vừa đủ dung dịch Tyrod. Ghi nhu động ruột thỏ sau khi đó nhỏ thuốc nghiờn cứu.
2.3.1.2. Nghiờn cứu tỏc dụng của CNTT đối với quỏ trỡnh cầm mỏu
- Nghiờn cứu này đo thời gian mỏu chảy, mỏu đụng, thời gian Quick, xỏc định tỷ lệ prothrombin, đếm số lượng tiểu cầu trong mỏu chuột nhắt và thỏ để đỏnh giỏ quỏ trỡnh cầm mỏu trờn thực nghiệm.
- Xỏc định liều dựng cho chuột nhắt và thỏ : chọn liều quy đổi gấp 12 lần và 3 lần liều dựng của người. Thuốc nghiờn cứu dựng với liều 100g/24h. Trọng lượng trung bỡnh một người là 50kg. Quy đổi sang liều dựng của chuột nhắt và thỏ tương đương liều dựng trờn lõm sàng lần lượt là 24g CNTT/kg và 6g/kg.
Trong nghiờn cứu này, CNTT được thử tỏc dụng ở 3 liều: tương đương liều dựng trờn lõm sàng, ẵ liều dựng trờn lõm sàng và gấp 1,5 lần liều dựng trờn lõm sàng. Liều dựng tương ứng trờn chuột nhắt sẽ là CNTT liều 12g/kg, 24g/kg và 36g/kg. Liều dựng tương ứng trờn thỏ sẽ là CNTT liều 3g/kg, 6g/kg và 12g/kg.
* Nghiờn cứu tỏc dụng của CNTT đối với thời gian mỏu chảy, thời gian mỏu đụng và số lượng tiểu cầu
- Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiờn thành 4 lụ, mỗi lụ 12 con: + Lụ 1 (lụ chứng): uống nước cất, thể tớch 0,2 ml/10g chuột. + Lụ 2: uống cao nước Thọ thai liều 12 g dược liệu/kg
+ Lụ 3: uống cao nước Thọ thai liều 24 g dược liệu/kg + Lụ 4: uống cao nước Thọ thai liều 36 g dược liệu/kg
- Chuột được uống nước cất hoặc thuốc nghiờn cứu trong 7 ngày liờn tục. Xột nghiệm được tiến hành tại 2 thời điểm trước và sau khi uống thuốc nghiờn cứu 7 ngày.
- Đặt đuụi chuột vào trong bỡnh ổn nhiệt nuụi cơ quan cụ lập, cắt đuụi chuột lấy giọt mỏu đầu tiờn cho lờn lam kớnh để tớnh thời gian mỏu đụng. Thời gian này được tớnh từ lỳc lấy giọt mỏu vào lam kớnh đến lỳc giọt mỏu đụng lại. Thời gian mỏu chảy được tớnh từ lỳc mỏu bắt đầu chảy đến khi mỏu ngừng chảy. Thớ nghiệm được tiến hành trong phũng cú nhiệt độ ổn định (280C). Sau đú chuột được lấy mỏu để đếm số lượng tiểu cầu.
* Nghiờn cứu tỏc dụng của CNTT đối với thời gian Quick và tỷ lệ prothrombin
- Thỏ chủng New Zealand White được chia ngẫu nhiờn thành 5 lụ: + Lụ 1: uống nước cất 2 ml/kg/ngày
+ Lụ 2: uống CNTTliều 3g dược liệu/kg/ngày + Lụ 3: uống CNTT liều 6g dược liệu /kg/ngày.
+ Lụ 4: uống CNTT liều 9g dược liệu/kg/ngày.
- Thỏ ở cỏc lụ 1, 2, 3 và 4 được uống nước cất hoặc cao nước Thọ thai trong 7 ngày liền. Ngày thứ 7, sau uống nước hoặc thuốc nghiờn cứu 2 giờ, lấy mỏu thỏ (lần 1) đo thời gian Quick và tớnh tỷ lệ prothrombin.
- Sau khi lấy mỏu lần 1, thỏ ở lụ 1 được uống nước cất, thỏ ở lụ 3, 4 và 5 được uống Sintrom (acenocoumarol) liều 0,5mg/kg.
+ Lụ 3: uống Sintrom 0,5mg/kg (đó uống CNTT liều 6g dược liệu/kg/ 24h trong 7 ngày).
+ Lụ 4: uống Sintrom 0,5mg/kg (đó uống CNTT liều 9g dược liệu/kg/ 24h trong 7 ngày).
+ Lụ 5 : uống Sintrom liều 0,5mg/kg.
- Sau khi uống Sintrom 24 giờ, lấy mỏu thỏ (lần 2) đo thời gian Quick và tớnh tỷ lệ prothrombin.
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ nghiờn cứu trờn thực nghiệm
Sơ đồ 2.5. Sơ đồ nghiờn cứu trờn thực nghiệm
Cơ tử cung, ruột cụ lập
Thời gian Quick TL prothrombin
Thỏ
cú thai 8-10 ngày New Zealand White
Chuột nhắt trắng
Swiss
Thỏ
New Zealand White
Tai cụ lập Truyờ̀n Ringer
Chỉ số huyết học
Tỏc dụng đối với cơ trơn tử cung, thành mạch, ruột
Mỏu đụng, mỏu chảy, tiểu cầu Đếm số giọt
dung dịch Tần số
biờn độ co cơ
Tỏc dụng đối với quỏ trỡnh
2.3.2. Nghiờn cứu lõm sàng
2.3.2.1. Thiết kế nghiờn cứu
Sử dụng phương phỏp thử nghiệm lõm sàng mở, so sỏnh trước - sau điều trị, cú đối chứng.
2.3.2.2. Phương phỏp chia nhúm
- Cỏc thai phụ dọa sẩy thai điều trị nội trỳ tại khoa Phụ bệnh viện Đa khoa YHCT Hà Nội đỏp ứng được tiờu chuẩn lựa chọn được đưa vào nhúm nghiờn cứu. Sau đú mới chọn cỏc thai phụ dọa sẩy thai điều trị nội trỳ tại khoa Phụ II bệnh viện Phụ sản Trung ương đỏp ứng được tiờu chuẩn nghiờn cứu đưa vào nhúm đối chứng đàm bảo tương đồng với nhúm nghiờn cứu theo cỏc tiờu chớ ghộp cặp.
- Ghộp cặp theo cỏc tiờu chớ: tuổi mẹ, tuổi thai và nồng độ βhCG mỏu khi vào viện.
+ Tuổi mẹ: chia tuổi mẹ thành cỏc nhúm cỏch nhau 5 tuổi (từ 20-24 tuổi, từ 25-29 tuổi, từ 30-34 tuổi, từ 35-39 tuổi, từ 40-44 tuổi...).
+ Tuổi thai: chia tuổi thai thành cỏc nhúm cỏch nhau 1 tuần tuổi (từ 5-6 tuần, từ 7-8 tuần, từ 9-10 tuần, từ 11-12 tuần, từ 13-14 tuần...).
+ Nồng độ βhCG mỏu: dựa vào bảng nồng độ βhCG mỏu bỡnh thường theo tuổi thai, chia thành hai nhúm: nồng độ bỡnh thường và nồng độ thấp.
Bỡnh thường: nồng độ βhCG mỏu tương ứng tuổi thai.
2.3.2.3. Phương phỏp dựng thuốc
+ Nhúm chứng (dựng thuốc YHHĐ): Utrogestan 100mgx4 viờn/24h, chia 2 lần uống trước ăn 60 phỳt. Spasmavộrine 40mg x 2 viờn/lần x 2 lần/ngày, uống. Dựng đến sau khi hết dấu hiệu dọa sẩy 7 ngày.
+ Nhúm nghiờn cứu (nhúm NC) dựng thuốc NC: cao nước “Thọ thai” uống ngày một tỳi 100ml, chia 2 lần, uống trước ăn 60 phỳt. Dựng đến sau khi hết dấu hiệu dọa sẩy 7 ngày.
2.3.2.4. Phương phỏp theo dừi thai phụ
- Tất cả cỏc thai phụ trong nghiờn cứu đều cú bệnh ỏn nghiờn cứu theo mẫu thống nhất, ghi đầy đủ cỏc thụng tin cần thiết. Bệnh ỏn nghiờn cứu bao gồm cỏc phần: hành chớnh, lý do vào viện, tiền sử, triệu chứng lõm sàng theo YHHĐ và YHCT, cỏc xột nghiệm, siờu õm, kết quả điều trị và ghi chỳ.
- Cỏc thai phụ trong nghiờn cứu nằm điều trị nội trỳ tại bệnh viện, được khỏm và theo dừi đầy đủ, chặt chẽ diễn biến đồng thời kiểm soỏt sự tuõn thủ điều trị hàng ngày.
2.3.2.5. Cỏc chỉ số theo dừi
Theo dừi kết quả điều trị theo cỏc chỉ số lõm sàng, cận lõm sàng.
* Chỉ số lõm sàng
- Theo dừi mạch: đếm mạch bằng một đồng hồ bấm giõy, đơn vị tớnh: lần/phỳt. Thai phụ được nằm nghỉ trước khi đếm mạch ớt nhất 15 phỳt, khụng dựng chất kớch thớch hay bất kỳ loại thuốc nào cú ảnh hưởng tới mạch. Bắt mạch ở rónh mạch quay tay trỏi của thai phụ, đếm số lần mạch đập trong thời gian 60 giõy. Mạch bỡnh thường từ 60-80 lần/phỳt, mạch <60 lần/phỳt là mạch chậm, mạch >80 lần/phỳt là mạch nhanh. Đỏnh giỏ xem mạch bỡnh thường khụng và cú thay đổi trong quỏ trỡnh điều trị khụng (tăng hay giảm).
- Theo dừi HA: đo HA cho thai phụ hàng ngày vào lỳc buổi sỏng ở tư thế