- Vi khuẩn Salmonella:
Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU đỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.4 Phương pháp xác ựịnh serotyp của vi khuẩn Salmonellaphân lập ựược (Phương pháp ựịnh type Salmonella bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên
(Phương pháp ựịnh type Salmonella bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh ( theo bảng cấu trúc kháng nguyên của Kauffmann-White )
- Sử dụng khay thuỷ tinh có các giếng nhỏ.
- Nhỏ 1 giọt nước sinh lý vào giếng ựầu tiên làm ựối chứng âm - Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh vào 1 giếng khác
- Dùng que cấy vô trùng lấy 1 ắt khuẩn lạc cần ựịnh type từ thạch ựã nuôi cấy (nutrient agar).
- Trộn ựều khuẩn lạc và kháng huyết thanh, lắc nhẹ nhàng và quan sát. + Phản ứng dương tắnh: có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti. + Phản ứng âm tắnh: huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh ựồng nhất không có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi ựục.
Một số chủng Salmonella có 2-3 pha kháng nguyên H. để xác ựịnh chủng ựó cần xác ựịnh pha 2 của kháng nguyên H. Sau khi xác ựịnh kháng nguyên H pha 1 theo sơ ựồ trên, tiến hành xác ựịnh pha 2 như sau:
- Chuẩn bị thạch Sven Gard: ựây là môi trường bán cố thể, có bán sẵn trên thị trường, chỉ cần pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dùng ựĩa Petri có ựường kắnh 6mm. Trước khi ựổ thạch nhỏ 1 giọt nhỏ Anti Sven Gard Serum với mục ựắch ức chế pha 1. Tuỳ theo pha 1 mà có loại Anti Sven Gard Serum khác nhau (SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6).
- Sau khi ựã có thạch Sven Gard, dùng que cấy vô trùng lấy một ắt vi khuẩn ựã xác ựịnh ựược kháng nguyên H pha 1, chấm nhẹ lên bề mặt thạch ở giữa ựĩa thạch.
- Nuôi ở 37oC/24h.
- Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh tương tự như ựối với pha 1
Bảng 2.1. Kháng huyết thanh ức chế Kháng nguyên H pha 1 STT Kháng huyết thanh Các kháng nguyên H pha 1 bị ức chế
1 SG1 a + b + c + z1
2 SG2 d + i + e,h
3 SG3 k + y + l,v + l,w + l,z13 + l,z28
4 SG4 r + z
5 SG5 e, n, x + e, n, z15
(Vắ dụ: Kháng nguyên H pha 1 xác ựịnh là Ai thì dùng SG2 ựể ức chế Ai) Trên cơ sở kết quả thu ựược, tiến hành ựịnh danh chủng vi khuẩn kiểm tra dựa vào bảng phân loại Kauffmann và White (Popoff, 2001).
2.4.4.1 Xác ựịnh nhóm kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh ựa giá nhóm O
Sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh (Slide agglutination) ựể xác ựịnh nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella. đây là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể ựược sử dụng rất phổ biến trong phòng thắ nghiệm ựể chẩn ựoán và giám ựịnh các loại vi khuẩn.
- Chuẩn bị:
+ Khuẩn lạc vi khuẩn ựược nuôi cấy vào thạch TSI hoặc thạch thường ựể tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
+ Kháng huyết thanh chuẩn ựa giá. - Tiến hành:
+ Chia 1 phiến kắnh sạch làm 2 phần: 1 phần làm ựối chứng, và 1 phần làm thắ nghiệm. Nhỏ vào mỗi bên phiến kắnh một giọt nước sinh lý.
+ Lấy một ắt khuẩn lạc Salmonella cần ựịnh typ ựã ựược cấy trên thạch TSI hoặc thạch thường, hòa với mỗi giọt nước muối sinh lý ựã nhỏ sẵn ở hai bên phiến kắnh thành huyễn dịch kháng nguyên.
O, còn bên ựối chứng âm, nhỏ thêm một giọt nước muối sinh lý. Trộn ựều, lắc nhẹ phiến kắnh trong khoảng 30 Ờ 60 giây.
+ đọc kết quả: Phản ứng dương tắnh khi có cụm ngưng kết kiểu hạt xuất hiện, huyễn dịch xung quanh trong. Bên ựối chứng âm huyễn dịch vẫn ựục ựều.
2.4.4.2 Xác ựịnh kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh ựơn giá nhóm O
Chủng cho kết quả dương tắnh với kháng huyết thanh O ựa giá, tiếp tục ựược xác ựịnh với các kháng huyết thanh ựơn giá. Cách làm tương tự như phương pháp ựã ựược trình bày ở phần 3.4.4.1.
2.4.4.3. Xác ựịnh kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella
Sau khi ựã xác ựịnh kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella, tiếp tục tiến hành xác ựịnh kháng nguyên H của chúng.
(i) Xác ựịnh kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 1)
- Chuẩn bị:
+ Chủng vi khuẩn Salmonella cần ựịnh typ ựược cấy trên môi trường thạch TSI hoặc thạch thường, ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
+ Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ, cấy vào môi trường nước BHI (5ml) ựể tủ ấm 37oC trong 2 giờ hoặc qua ựêm ở nhiệt ựộ phòng. Sau ựó, thêm vào canh trùng 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung formalin (nước sinh lý + 1% Formalin) nhằm mục ựắch là ựể cố ựịnh kháng nguyên H.
+ Kháng huyết thanh nhóm H gồm: Ha, Hb, Hc, Hd, He,h, HG, Hi, Hk, HL, Hr, Hy, He,n, H1
- Tiến hành:
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh từ Ha ựến H1 vào mỗi ống nghiệm. + Dùng Micropipet, hút 450 ộl canh trùng Salmonella ựã xử lý ở trên và cho vào ống nghiệm ựã có chứa kháng huyết thanh.
+ Lắc nhẹ ựể trộn ựều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống nghiệm, sau ựó ựặt vào bể ủ nhiệt ở nhiệt ựộ 50oC trong 1 giờ.
+ đọc kết quả: Phản ứng dương tắnh thì có ngưng kết kiểu ựám mây, các cụm ngưng kết tương ựối lỏng lẻo. Phản ứng âm tắnh thì dung dịch trong ống nghiệm ựục ựều.
(ii) Xác ựịnh kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 2)
Sau khi có kết quả xác ựịnh kháng nguyên H pha 1 của các chủng
Salmonella, chúng tôi tiến hành xác ựịnh tiếp kháng nguyên H pha 2 của chúng. + Hút 3,5 ml môi trường nước thịt HI hoặc BHI có chứa 0,25% thạch vào trong 1 ống nghiệm có nút vặn, có chứa sẵn 1 ống thủy tinh nhỏ hở 2 ựầu.
+ để ống nghiệm ựó vào bể ủ nhiệt ở 50oC trong 15 phút, sau ựó nhỏ 50 ộl kháng huyết thanh tương ứng với kết quả của pha 1 vào ống nghiệm.
+ Dùng que cấy thẳng, lấy 1 khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần ựịnh typ, cấy thẳng vào phắa trong của ống thủy tinh nhỏ sâu khoảng 1-1,5cm. Sau ựó ủ ở tủ ấm 37oC trong vòng 24 giờ.
+ Lấy 1 vòng que cấy của chủng vi khuẩn ựã phát triển trong môi trường (chủng này có thể di chuyển qua thạch mà không bị ức chế), cấy vào 1 ống nghiệm có chứa 5 ml BHI, ựể nghiêng tuýp trong tủ ấm 37oC trong vòng 6 giờ.
+ Thêm vào ựó 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung formalin (nước muối sinh lý + 1% formalin), ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 2 giờ.
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh tương ứng với kết quả của các chủng tạo pha 2 vào mỗi ống nghiệm.
+ Dùng micropipet hút 450 ộl canh trùng Salmonella ựã xử lý ở trên và cho vào ống nghiệm ựã có chứa kháng huyết thanh.
+ Lắc nhẹ ựể trộn ựều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống nghiệm, sau ựó ựặt vào bể ủ nhiệt ở nhệt ựộ 50oC trong 1 giờ.
+ đọc kết quả: Phản ứng dương tắnh thì có ngưng kết kiểu ựám mây, các cụm ngưng kết tương ựối lỏng lẻo. Phản ứng âm tắnh thì dung dịch trong ống nghiệm ựục ựều.