3.5.1.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM – T Easy
Vector pGEM - T Easy tồn tại ở dạng mạch thẳng với 2 đầu tƣ do mỗi đầu thừa ra 1 nucleotide T nên dễ dàng bắp cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu so le A của sản phẩm PCR khi sử dụng Taq polymerase vì thế chúng tôi chọn vector pGEM - T Easy làm vector tách dòng. Đoạn gen tính toán theo lý thuyết 1060 bp thu đƣợc từ sản phẩm PCR của chủng ĐNT 9.5 đƣợc gắn trực tiếp vào vector pGEM - T Easy đƣợc thực hiện ở 40C cùng với enzyme T4 - ligase. Sản phẩm là vector tái tổ hợp pGEM - T Easy - cry3A - ĐNT 9.5.
3.5.1.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợpvào E.coli DH5α
Tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp trên vào tế bào khả biến E.coli
DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Sau khi biến nạp, chủng E.coli DH5α mang vector tái tổ hợp pGEM - T Easy - cry3A đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB + ampicillin + X-gal + IPTG ở 370C qua đêm thấy xuất hiện những khuẩn lạc màu xanh và trắng xen kẽ nhau (hình 3.6).
Hình 3.6. Hình ảnh khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trƣờng LBA sau khi nuôi cấy qua đêm.
1: khuẩn lạc xanh 2: khuẩn lạc trắng
1 2
Khuẩn lạc xanh xuất hiện là do promoter của lac - operon trên vectơ pGEM -T Easy vẫn hoạt động bình thƣờng nên Enzyme ß - galactosidase vẫn đƣợc tổng hợp (vẫn có khả năng chuyển hóa X - gal từ không màu sang màu xanh chàm).
Khuẩn lạc trắng xuất hiện là do hai nguyên nhân sau: Nguyên nhân thứ nhất có thể là do tế bào vi khuẩn nhận đƣợc vectơ tái tổ hợp mang đoạn DNA chèn vào giữa vùng lac - operon của gen cấu trúc lacz làm hỏng promoter của gen lac - operon trong vectơ pGEM - T Easy nên trong quá trình phát triển nó không tạo ra Enzyme ß - galactosidase, không có khả năng chuyển hoá đƣợc cơ chất x - gal có trong môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn vì vậy mà không có màu xanh. Nguyên nhân thứ hai có thể là do promoter điều khiển hoạt động của gen mã hoá cho Enzyme ß - galactosidase bị hỏng, dẫn đến không tạo ra đƣợc enzym ß - galactosidase do đó mà vi khuẩn E. coli không chuyển hoá đƣợc X - gal có trong môi trƣờng nên tạo thành các khuẩn lạc màu trắng.
Để biết các dòng khuẩn lạc trắng có mang gen mong muốn hay không chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phƣơng pháp tách DNA plasmid và cắt bằng Enzyme giới hạn. Các dòng khuẩn lạc trắng đƣợc cấy vào môi trƣờng LB có bổ sung ampicillin nuôi lắc qua đêm để tách plasmid.
3.5.1.3. Kiểm tra sự có mặt của gen cry3A trong các dòng Plasmid tái tổ hợp
Do vector pGEM - T Easy có chứa vị trí cắt của Enzyme EcoRI tiếp giáp với vùng đa cắt nối (vùng cho phép cài gắn các đoạn gen cần tách dòng) nên chúng tôi sử dụng Enzyme EcoRI để kiểm tra và đảm bảo quá trình tách dòng thực hiện thành công với vector tái tổ hợp pGEM - T Easy - cry3A (hình 3.7).
Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmide tách chiết từ các dòng khuẩn lạc ĐNT 9.5 trên agarose 1%.
(Giếng 1,2,3,4: Sản phẩm cắt DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc trắng). giếng 5: Marker).
Kết quả trên cho thấy plasmid của các dòng khuẩn lạc trắng sau khi cắt bằng Enzyme EcoRI tạo ra 2 băng, băng lớn là vector tách dòng pGEM – T Easy có kích thƣớc khoảng 3000 bp, băng nhỏ có kích thƣớc khoảng hơn 1000 bp tƣơng ứng với sản phẩm PCR của gen cry3A. Điều này chứng tỏ plasmid tái tổ hợp pGEM – T Easy - cry3A - ĐNT 9.5 có mang đoạn gen cry3A.
Để có thể kết luận chính xác hơn về plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen
cry3A hay không chúng tôi tiến hành chạy PCR với khuôn DNA là các plasmid tái tổ hợp trên sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen cry3A.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và kết quả chỉ có xuất hiện băng với kích thƣớc 1060 bp giống với sản phẩm PCR tổng số của gen cry3A (hình 3.8).
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ DNA plasmid các dòng khuẩn lạc của chủng ĐNT 9.5 đã biến nạp bằng mồi đặc hiệu gen cry3A
( giếng 1,2: ĐNT 9.5, giếng 3: Marker)
Từ những kết quả thu đƣợc ở trên, bƣớc đầu chúng tôi có thể kết luận là đã tách dòng thành công gen cry3A trong vector pGEM - T Easy. Tuy nhiên, để kiểm tra chính xác gen tách dòng là gen cry3A hay không, chúng tôi tiến hành đọc trình tự đoạn gen này và so sánh với các trình tự gen đã đăng ký trong Ngân hàng Gen quốc tế bằng phần mềm chuyên dụng.