3.3.1. Xác định nồng độ bào tử
Trƣớc khi tiến hành thử hoạt tính diệt mọt thóc đỏ, chúng tôi tiến hành xác định nồng độ bào tử của các chủng Bt có khả năng thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis phân lập đƣợc tại đất Quảng Nam và Nha Trang. Các bƣớc thực hiện đã đƣợc trình bày trong mục 2.2.4.1 của phần vật liệu và phƣơng pháp. Nồng độ bào tử của các chủng đem thử hoạt tính đều dao động trong khoảng 1.1010
– 1,3. 1011 bào tử/ml.
3.3.2. Thử hoạt tính sinh học với mọt thóc đỏ trƣởng thành của các chủng
Bt phân lập
Các chủng Bt đƣợc pha loãng tới nồng độ 1.107
- 1.109 bào tử/ml bằng nƣớc cất vô trùng. Tiến hành thử hoạt tính trên các chủng đã xác định là dƣới loài Bt.tenebrionis. Tỷ lệ mọt thóc đỏ chết đƣợc tính sau 5 ngày thử nghiệm. Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.3, hình 3.4.
Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng thành của các chủng Bt sau 5 ngày thử nghiệm.
Tên chủng Tỷ lệ mọt chết (%) Nồng độ 107 bào tử/ml Nồng độ 109 bào tử/ml ĐNT 9.5 73,3 80,6 ĐNT 7.2 33,33 56,67 ĐNT 8.4 56,67 72,1 ĐNT 5.3 62,3 72,1 ĐNT 6.2 56,67 71,8 LNT 5.3 33,33 62,3 LNT 14.8 20 47,6 ĐTXTT 1.7 62,3 78,1 ĐTXTT 3.10 15 47,6
Hình 3.4. Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng và mọt thóc đỏ trƣởng
Từ bảng 3.3 cho thấy hoạt tính diệt mọt thóc đỏ của các chủng Bt phân lập đƣợc là tƣơng đối cao. Sau 5 ngày thử nghiệm, kết quả cho thấy cả 9 chủng đều có hoạt tính diệt mọt thóc đỏ, tuy nhiên trong đó có chủng ĐNT 9.5 có tỷ lệ chết cao nhất > 80 % ở nồng độ 109
bào tử/ml. Chủng này đƣợc chọn để sàng lọc gen cry3A bằng phƣơng pháp PCR.
3.4. Sàng lọc gen cry3A ở các chủng Bt bằng phƣơng pháp PCR
Để phát hiện và sàng lọc gen độc tố cry3A chúng tôi sử dụng phƣơng pháp PCR để khuyếch đại gen này với cặp mồi đặc hiệu của chúng. Theo tính toán lý thuyết, đoạn gen cry3A sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu sẽ thu đƣợc sản phẩm có kích thƣớc 1060 bp .Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen cry3A trên gel agarose 1%
( Giếng 1: ĐNT 7.2, giếng 2: ĐTXTT 3.10, giếng 3: ĐNT 9.5, giếng 4: Marker, giếng 5: ĐNT 8.4,giếng 6: ĐNT 5.3,giếng 7: LNT 14.8, giếng 8:
ĐTXTT 1.7)
Kết quả thí nghiệm (hình 3.5) cho thấy từ 7 chủng nghiên cứu có 7 chủng cho sản phẩm PCR xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng hơn 1000 bp đúng nhƣ tính toán lý thuyết. Nhƣ vậy, sơ bộ nhận xét 7 chủng này mang gen
cry3A và thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis trong đó có 2 chủng từ Quảng Nam và 5 chủng từ Nha Trang.
Trong 7 chủng mang gen cry3A thì có một chủng là ĐNT 9.5 là có hoạt lực cao nhất đối với mọt thóc đỏ. Để khẳng định đoạn gen này có chắc chắn là
gen cry3A hay không, chúng tôi đã tiến hành tách dòng và đọc trình tự gen
cry3A của chủng ĐNT 9.5 (Đất Nha Trang).
3.5. Kết quả tách dòng gen và đọc trình tự gen cry3A
3.5.1. Kết quả tách dòng gen cry3A
3.5.1.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM – T Easy
Vector pGEM - T Easy tồn tại ở dạng mạch thẳng với 2 đầu tƣ do mỗi đầu thừa ra 1 nucleotide T nên dễ dàng bắp cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu so le A của sản phẩm PCR khi sử dụng Taq polymerase vì thế chúng tôi chọn vector pGEM - T Easy làm vector tách dòng. Đoạn gen tính toán theo lý thuyết 1060 bp thu đƣợc từ sản phẩm PCR của chủng ĐNT 9.5 đƣợc gắn trực tiếp vào vector pGEM - T Easy đƣợc thực hiện ở 40C cùng với enzyme T4 - ligase. Sản phẩm là vector tái tổ hợp pGEM - T Easy - cry3A - ĐNT 9.5.
3.5.1.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợpvào E.coli DH5α
Tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp trên vào tế bào khả biến E.coli
DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Sau khi biến nạp, chủng E.coli DH5α mang vector tái tổ hợp pGEM - T Easy - cry3A đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB + ampicillin + X-gal + IPTG ở 370C qua đêm thấy xuất hiện những khuẩn lạc màu xanh và trắng xen kẽ nhau (hình 3.6).
Hình 3.6. Hình ảnh khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trƣờng LBA sau khi nuôi cấy qua đêm.
1: khuẩn lạc xanh 2: khuẩn lạc trắng
1 2
Khuẩn lạc xanh xuất hiện là do promoter của lac - operon trên vectơ pGEM -T Easy vẫn hoạt động bình thƣờng nên Enzyme ß - galactosidase vẫn đƣợc tổng hợp (vẫn có khả năng chuyển hóa X - gal từ không màu sang màu xanh chàm).
Khuẩn lạc trắng xuất hiện là do hai nguyên nhân sau: Nguyên nhân thứ nhất có thể là do tế bào vi khuẩn nhận đƣợc vectơ tái tổ hợp mang đoạn DNA chèn vào giữa vùng lac - operon của gen cấu trúc lacz làm hỏng promoter của gen lac - operon trong vectơ pGEM - T Easy nên trong quá trình phát triển nó không tạo ra Enzyme ß - galactosidase, không có khả năng chuyển hoá đƣợc cơ chất x - gal có trong môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn vì vậy mà không có màu xanh. Nguyên nhân thứ hai có thể là do promoter điều khiển hoạt động của gen mã hoá cho Enzyme ß - galactosidase bị hỏng, dẫn đến không tạo ra đƣợc enzym ß - galactosidase do đó mà vi khuẩn E. coli không chuyển hoá đƣợc X - gal có trong môi trƣờng nên tạo thành các khuẩn lạc màu trắng.
Để biết các dòng khuẩn lạc trắng có mang gen mong muốn hay không chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phƣơng pháp tách DNA plasmid và cắt bằng Enzyme giới hạn. Các dòng khuẩn lạc trắng đƣợc cấy vào môi trƣờng LB có bổ sung ampicillin nuôi lắc qua đêm để tách plasmid.
3.5.1.3. Kiểm tra sự có mặt của gen cry3A trong các dòng Plasmid tái tổ hợp
Do vector pGEM - T Easy có chứa vị trí cắt của Enzyme EcoRI tiếp giáp với vùng đa cắt nối (vùng cho phép cài gắn các đoạn gen cần tách dòng) nên chúng tôi sử dụng Enzyme EcoRI để kiểm tra và đảm bảo quá trình tách dòng thực hiện thành công với vector tái tổ hợp pGEM - T Easy - cry3A (hình 3.7).
Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmide tách chiết từ các dòng khuẩn lạc ĐNT 9.5 trên agarose 1%.
(Giếng 1,2,3,4: Sản phẩm cắt DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc trắng). giếng 5: Marker).
Kết quả trên cho thấy plasmid của các dòng khuẩn lạc trắng sau khi cắt bằng Enzyme EcoRI tạo ra 2 băng, băng lớn là vector tách dòng pGEM – T Easy có kích thƣớc khoảng 3000 bp, băng nhỏ có kích thƣớc khoảng hơn 1000 bp tƣơng ứng với sản phẩm PCR của gen cry3A. Điều này chứng tỏ plasmid tái tổ hợp pGEM – T Easy - cry3A - ĐNT 9.5 có mang đoạn gen cry3A.
Để có thể kết luận chính xác hơn về plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen
cry3A hay không chúng tôi tiến hành chạy PCR với khuôn DNA là các plasmid tái tổ hợp trên sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen cry3A.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và kết quả chỉ có xuất hiện băng với kích thƣớc 1060 bp giống với sản phẩm PCR tổng số của gen cry3A (hình 3.8).
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ DNA plasmid các dòng khuẩn lạc của chủng ĐNT 9.5 đã biến nạp bằng mồi đặc hiệu gen cry3A
( giếng 1,2: ĐNT 9.5, giếng 3: Marker)
Từ những kết quả thu đƣợc ở trên, bƣớc đầu chúng tôi có thể kết luận là đã tách dòng thành công gen cry3A trong vector pGEM - T Easy. Tuy nhiên, để kiểm tra chính xác gen tách dòng là gen cry3A hay không, chúng tôi tiến hành đọc trình tự đoạn gen này và so sánh với các trình tự gen đã đăng ký trong Ngân hàng Gen quốc tế bằng phần mềm chuyên dụng.
3.5.2. Xác định trình tự đoạn gen cry3A
Sau khi thu nhận đƣợc plasmid có chứa đoạn gen cry3A, chúng tôi tiến hành đọc trình tự gen này bằng máy đọc trình tự DNA tự động. Trình tự này đƣợc so sánh với 2 trình tự có mã số M 37207.1 và EU 332160.1 trên ngân hành gen quốc tế. Kết quả cho thấy trình tự đoạn gen cry3A từ chủng ĐNT 9.5 có chiều dài 1060 bp và có độ tƣơng đồng 99% so với trình tự tƣơng ứng của 2 chủng đã công bố trên ngân hàng gen. (hình 3.9) với vị trí sai khác là một nucleotide 396 C → T:
10 20 30 40 50 60 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT9.5 AGGTGCCAAC TAACCATGTT CAATATCCTT TAGCGGAAAC TCCAAATCCA ACACTAGAAG
M37207.1 AGGTGCCAAC TAACCATGTT CAATATCCTT TAGCGGAAAC TCCAAATCCA ACACTAGAAG
EU332160.1 AGGTGCCAAC TAACCATGTT CAATATCCTT TAGCGGAAAC TCCAAATCCA ACACTAGAAG
70 80 90 100 110 120 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT9.5 ATTTAAATTA TAAAGAGTTT TTAAGAATGA CTGCAGATAA TAGTACGGAA GCACTAGATA
M37207.1 ATTTAAATTA TAAAGAGTTT TTAAGAATGA CTGCAGATAA TAATACGGAA GCACTAGATA
EU332160.1 ATTTAAATTA TAAAGAGTTT TTAAGAATGA CTGCAGATAA TAATACGGAA GCACTAGATA
130 140 150 160 170 180 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT9.5 GCTCTACAAC AAAAGATGTC ATTCAAAAAG GCATTTCCGT AGTAGGTGAT CTCCTAGGCG
M37207.1 GCTCTACAAC AAAAGATGTC ATTCAAAAAG GCATTTCCGT AGTAGGTGAT CTCCTAGGCG
EU332160.1 GCTCTACAAC AAAAGATGTC ATTCAAAAAG GCATTTCCGT AGTAGGTGAT CTCCTAGGCG 1060 bp
190 200 210 220 230 240 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT9.5 TAGTAGGTTT CCCGTTTGGT GGAGCGCTTG TTTCGTTTTA TACAAACTTT TTAAATACTA
M37207.1 TAGTAGGTTT CCCGTTTGGT GGAGCGCTTG TTTCGTTTTA TACAAACTTT TTAAATACTA
EU332160.1 TAGTAGGTTT CCCGTTTGGT GGAGCGCTTG TTTCGTTTTA TACAAACTTT TTAAATACTA
250 260 270 280 290 300 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT9.5 TTTGGCCAAG TGAAGACCCG TGGAAGGCTT TTATGGAACA AGTAGAAGCA TTGATGGATC M37207.1 TTTGGCCAAG TGAAGACCCG TGGAAGGCTT TTATGGAACA AGTAGAAGCA TTGATGGATC EU332160.1 TTTGGCCAAG TGAAGACCCG TGGAAGGCTT TTATGGAACA AGTAGAAGCA TTGATGGATC 310 320 330 340 350 360 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT9.5 AGAAAATAGC TGATTATGCA AAAAATAAAG CTCTTGCAGA GTTACAGGGC CTTCAAAATA
M37207.1 AGAAAATAGC TGATTATGCA AAAAATAAAG CTCTTGCAGA GTTACAGGGC CTTCAAAATA
EU332160.1 AGAAAATAGC TGATTATGCA AAAAATAAAG CTCTTGCAGA GTTACAGGGC CTTCAAAATA
370 380 390 400 410 420 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT9.5 ATGTCGAAGA TTATGTGAGT GCATTGAGTT CATGGTAAA AAGTCCTGTG AGTTCGCGGA
M37207.1 ATGTCGAAGA TTATGTGAGT GCATTGAGTT CATGGCAAAA AAATCCTGTG AGTTCACGAA
EU332160.1 ATGTCGAAGA TTATGTGAGT GCATTGAGTT CATGGCAAAA AAATCCTGTG AGTTCACGAA
430 440 450 460 470 480 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT9.5 ATCCACATAG CCAGGGGCGG ATAAGAGAGC TGTTTTCTCA AGCAGGAAGT CATTTTCGTA M37207.1 ATCCACATAG CCAGGGGCGG ATAAGAGAGC TGTTTTCTCA AGCAGAAAGT CATTTTCGTA EU332160.1 ATCCACATAG CCAGGGGCGG ATAAGAGAGC TGTTTTCTCA AGCAGAAAGT CATTTTCGTA 490 500 510 520 530 540 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT9.5 ATTCGATGCC TTCGTTTGCA ATTTCTGGAT ACGAGGTTCT ATTTCTAACA ACATATGCAC M37207.1 ATTCAATGCC TTCGTTTGCA ATTTCTGGAT ACGAGGTTCT ATTTCTAACA ACATATGCAC EU332160.1 ATTCAATGCC TTCGTTTGCA ATTTCTGGAT ACGAGGTTCT ATTTCTAACA ACATATGCAC 550 560 570 580 590 600 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT9.5 AAGCTGCCAA CACACATTTA TTTTTACTAA AAGACGCTCA AATTTATGGA GAAGAATGGG M37207.1 AAGCTGCCAA CACACATTTA TTTTTACTAA AAGACGCTCA AATTTATGGA GAAGAATGGG EU332160.1 AAGCTGCCAA CACACATTTA TTTTTACTAA AAGACGCTCA AATTTATGGA GAAGAATGGG 610 620 630 640 650 660 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT9.5 GATACGAAAA AGAAGATATT GCTGAATTTT ATAAAAGACA ACTAAAACTT ACGCAAGAAT
M37207.1 GATACGAAAA AGAAGATATT GCTGAATTTT ATAAAAGACA ACTAAAACTT ACGCAAGAAT
EU332160.1 GATACGAAAA AGAAGATATT GCTGAATTTT ATAAAAGACA ACTAAAACTT ACGCAAGAAT
670 680 690 700 710 720 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
ĐNT9.5 ATACTGACCA TTGTGTCAAA TGGTATAATG TTGGATTAGA TAAATTAAGA GGTTCATCTT
M37207.1 ATACTGACCA TTGTGTCAAA TGGTATAATG TTGGATTAGA TAAATTAAGA GGTTCATCTT
EU332160.1 ATACTGACCA TTGTGTCAAA TGGTATAATG TTGGATTAGA TAAATTAAGA GGTTCATCTT
730 740 750 760 770 780 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT9.5 ATGAATCTTG GGTAAACTTT AACCGTTATC GCAGAGAGAT GACATTAACA GTATTAGATT M37207.1 ATGAATCTTG GGTAAACTTT AACCGTTATC GCAGAGAGAT GACATTAACA GTATTAGATT EU332160.1 ATGAATCTTG GGTAAACTTT AACCGTTATC GCAGAGAGAT GACATTAACA GTATTAGATT 790 800 810 820 830 840 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT9.5 TAATTGCACT ATTTCCATTG TATGATGTTC GGCTATACCC AAAAGAAGTT AAAACCGAAT M37207.1 TAATTGCACT ATTTCCATTG TATGATGTTC GGCTATACCC AAAAGAAGTT AAAACCGAAT
850 860 870 880 890 900 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT9.5 TAACAAGAGA CGTTTTAACA GATCCAATTG TCGGAGTCAA CAACCTTAGG GGCTATGGAA M37207.1 TAACAAGAGA CGTTTTAACA GATCCAATTG TCGGAGTCAA CAACCTTAGG GGCTATGGAA EU332160.1 TAACAAGAGA CGTTTTAACA GATCCAATTG TCGGAGTCAA CAACCTTAGG GGCTATGGAA 910 920 930 940 950 960 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT9.5 CAACCTTCTC TAATATAGAA AATTATATTC GAAAACCACA TCTATTTGAC TATCTGCATA M37207.1 CAACCTTCTC TAATATAGAA AATTATATTC GAAAACCACA TCTATTTGAC TATCTGCATA EU332160.1 CAACCTTCTC TAATATAGAA AATTATATTC GAAAACCACA TCTATTTGAC TATCTGCATA 970 980 990 1000 1010 1020 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT9.5 GAATTCAATT TCACACGCGG TTCCAACCAG GATATTATGG AAATGACTCT TTCAATTATT M37207.1 GAATTCAATT TCACACGCGG TTCCAACCAG GATATTATGG AAATGACTCT TTCAATTATT EU332160.1 GAATTCAATT TCACACGCGG TTCCAACCAG GATATTATGG AAATGACTCT TTCAATTATT 1030 1040 1050 1060 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ĐNT9.5 GGTCCGGTAA TTATGTTTCA ACTAGACCAA GCATAGGATC M37207.1 GGTCCGGTAA TTATGTTTCA ACTAGACCAA GCATAGGATC EU332160.1 GGTCCGGTAA TTATGTTTCA ACTAGACCAA GCATAGGATC
Hình 3.9: So sánh trình tự đoạn gen cry3A của chủng ĐNT9.5 với mã 2 trình tự có mã số M37207.1 và EU 332160.1
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1.Đã phân lập và tuyển chọn đƣợc 35 chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất ở Nha Trang và Quảng Nam với 11 chủng mang tinh thể hình lập phƣơng chiếm 31,4%, 8 chủng mang tinh thể hình cầu chiếm 22,8%, 11chủng mang tinh thể hình lƣỡng tháp chiếm 31.4% và 5 chủng còn lại mang tinh thể có hình không xác định chiếm 14,4%. Đã phân loại đƣợc 9 chủng dƣới loài Bt
subsp. tenebrionis bằng phƣơng pháp huyết thanh. (ĐNT 9.5; ĐNT 8.4; ĐNT 5.3; ĐNT 7.2; ĐNT 6.2; LNT 5.3; LNT 14.8; ĐTXTT 1.7; ĐTXTT 3.10).
2.Đã tuyển chọn đƣợc 9 chủng trên có hoạt tính diệt mọt thóc đỏ và trong đó có chủng ĐNT 9.5 có hoạt tính cao >80%;
3.Bằng phƣơng pháp PCR đã phát hiện đƣợc 7 chủng mang gen cry3A từ các chủng thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis. Đoạn gen có kích thƣớc 1060 bp.
4.Đã tách dòng và giải trình tự gen đoạn gen đặc hiệu cry3A của chủng ĐNT9.5 mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh cứng và so sánh trên ngân hàng gen quốc tế có độ tƣơng đồng là 99% với 2 trình có mã số M37207.1 và EU 332160.1.
KIẾN NGHỊ
Đây là đoạn gen quý mã hóa protein có khả năng diệt mọt thóc đỏ gây hại ngũ cốc trong kho lƣơng thực. Vì vậy chúng tôi kiến nghị cần đƣợc nghiên cứu tiếp để tạo ra những chế phẩm nhằm phục vụ mục đích bảo vệ cho các kho lƣơng thực thay thế cho các hóa chất độc hại đang dùng hiện nay. Là nguyên liệu chuyển gen cry3A vào cây trồng giúp cây trồng có khả năng kháng lại côn trùng bộ cánh cứng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Ngô Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Hƣơng, Nguyễn Thị Luy, Lê thị Hồng Nhung, Đặng Văn Tiến. 2010, 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học
Bacillus Thuringiensis tại Việt Nam. Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm thành lập Viện Khoa học và Công nghệ VIệt Nam 1975-2010. Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và công nghệ. 288-300.
2. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt. 2002. Thu nhận huyết thanh miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis. Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 200-2001. 296-303.
3. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thƣởng, Nguyễn Ánh Nguyệt, Trịnh Thế Cƣờng, Jasser Mohamad Jamil, Ngô Đình Anh Trí, Nguyễn Hoài Trâm. 2000. Nghiên cứu sự phân bố và đa dạng sinh học của Bacillus thuringiensis phân lập từ một số tỉnh ở Việt Nam. “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sinh học”. Báo cáo khoa học hội nghị sinh học quốc gia. 484-488.
4. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thƣởng, Trịnh Thị Ngọt, Nguyễn Ánh Nguyệt. 2000. Sự phân bố của Bacillus thuringiensis
trong các mẫu đất của Việt Nam. Tài nguyên sinh vật đất và sự phát triển bền vững của hệ sinh thái đất. 1-7.
5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tỵ. 2000. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản giáo dục.
6. Hoàng Thị Lợi. 2003. Giáo trình côn trùng học nông nghệp đại cƣơng tập 2. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. Trang 122 – 167.
7. Đặng Trọng Lƣơng, R. Offringa, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý, W. Dolf và Paul J.J. Hooykaas. 1999. Thiết kế cấu trúc gen
Bt (Bacillus thuringiensis) Ubiquitin promoter-CryIA(c) để chuyển vào cây hai lá mầm. Báo Cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà nội 1999. Tr. 1371-1378.
8. Khuất Hữu Thanh. 2004. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật. 109-147.