2.2.6.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM - T Easy
Sản phẩm PCR đƣợc gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng nhờ Enzyme nối T4 - ligase.
Thành phần của quá trình gắn gen vào vectơ:
2X ligation buffer 5 µl
Vectơ: pGEM - T Easy 1 µl
Enzyme nối T4 - ligase 1 µl
PCR product 5 µl
Quá trình nối ghép đƣợc tiến hành 14 – 16 giờ ở 40C.
Sau khi gắn xong để vào đá cho vào tủ lạnh qua đêm.
2.2.6.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α
Chuẩn bị tế bào khả biến:
Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong môi trƣờng LB lỏng qua đêm.
Chuyển 0,5 ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50 ml môi trƣờng LB, lắc 200 vòng/ phút trong 2 giờ ở 370C. Khi đo OD600 đạt 0,5 - 0,6 thì lấy mẫu ra đặt trên đá 1 giờ.
Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút loại bỏ dịch nổi. Hòa tế bào thu đƣợc trong 50 ml CaCl2 100 mM vô trùng. Mẫu đƣợc ủ 15 phút và ly tâm thu tế bào ở 6000 vòng/phút.
Hòa lại tủa trong 25 ml CaCl2 100 mM, bổ sung 15% glycerol.
Hút 10 µl dịch tế bào vào mỗi ống eppendorf và bảo quản -800C.
Quy trình biến nạp:
Bổ sung 5 µl sản phẩm lai vào E. coli đã làm tế bào khả biến.
Ủ đá trong 30 phút nhằm tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vectơ tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều.
Sốc nhiệt ở 420C (60 - 90s), sau đó giữ hỗn hợp này trong đá 2 phút.
Bổ sung 300 µl môi trƣờng LB, lắc ở 370C , 200 vòng/phút trong 1 - 1,5 giờ.
Hút 150 µl sản phẩm trong vào đĩa Petri có chứa môi trƣờng LBA có bổ sung kháng sinh ampicillin + Xgal nuôi ở 370C trong 14 - 16 giờ.
2.2.6.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid của vi khuẩn E.coli DH5α
Lấy khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp (chọn khuẩn lạc trắng) cấy vào 5 ml LB có chứa chất kháng sinh ampicilin, nuôi lắc qua đêm ở 370C, 200 vòng/phút.
Lấy 1,5 ml dịch nuôi, ly tâm 6000vòng/phút trong 10 phút.
Loại dịch nổi thu cặn.
Bổ sung 150 µl Sol I, votex làm tan tủa.
Bổ sung 150 µl Sol II, đảo nhẹ tay.
Bổ sung 150 µl Sol III, đảo nhẹ.
Ly tâm 10.000 vòng/phút( 40C, 10 phút), thu dịch nổi vào ống effendorf mới.
Bổ sung 1ml cồn tuyệt đối tủa ở -200C ít nhất trong 1 giờ (tốt nhất là 4 giờ). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa.
Làm khô và hòa tủa trong 45 µl RNA ủ trong tủ 370C trong 1 giờ.
Đẩy nƣớc tới 500 µl.
Bổ sung chloroform: Isoamylalcohol (24:1) tỷ lệ 1:1
Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.
Thu dịch nổi
Bổ sung NaOAC/ KOAC (1:10), sau đó tiếp tục bổ sung cồn 100% tỷ lệ 2,5:1
Ủ ở tủ -20o
C ít nhất trong 4 giờ.
Rửa tủa bằng cồn 70% (200 µl)
Ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút, thu tủa.
Làm khô
Hòa tủa trong 45 µl nƣớc.
2.2.6.4. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn EcoRI
Để xác định chính xác vector tái tổ hợp có mang đoạn gen mong muốn hay không tiến hành cắt đoạn DNA đã ghép nối vào plasmide bằng EcoRI.
Thành phần phản ứng:
EcoRI 1 µl Buffer 1 µl DNA plasmide 3 µl dH2O 5 µl
Quá trình cắt đƣợc tiến hành ở 370C trong 4 giờ.
2.2.6.5. Xác định trình tự nucleotide của đoạn gen đã tách dòng
Tiến hành theo phƣơng pháp tổng hợp của Sanger và cộng sự. Thực hiện phản ứng PCR ngoài các thành phần thông thƣờng còn bổ sung thêm 4 loại dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, dd TTP) và đƣợc đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang.
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide bổ sung ure để làm tăng độ phân giải của gen. Sử dụng tia laze quét phát hiện dideoxynucleotide đã đánh dấu.
Xử lý kết quả bằng máy đọc trình tự DNA tự động, sau đó so sánh trình tự gen đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen quốc tế.
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN