Vectơ tách dòng

Tùy thuộc vào kích thƣớc đoạn DNA muốn tạo dòng và mục đích tạo dòng mà chọn vectơ thích hợp. Vectơ pGEM - T easy hiện nay thƣờng đƣợc sử dụng. Vectơ pGEM - T easy có hiệu quả tách dòng cao và đƣợc ứng dụng rộng rãi do kích thƣớc tƣơng đối nhỏ 3015 bp: Vectơ pGEM - T easy đƣợc thiết kế với một 3‟ - thymidine ở cả 2 đầu. T - nhô ra ở vị trí gắn để tăng hiệu quả của quá trình gắn sản phẩm PCR bằng cách ngăn chặn việc tự khép vòng của vectơ và cung cấp một đầu T tƣơng thích với đầu A của sản phẩm PCR đã đƣợc tạo ra bởi các enzyme tổng hợp.

Vectơ pGEM - T easy là vectơ có số lƣợng bản copy cao, chứa các promoter T7 và SPS6 RNA polymerase nằm cạnh vùng MCR, bên trong đoạn mã cho α - peptide và đoạn mã cho Enzyme β - galactosidase. Sự bất hoạt do hoạt động chèn vào của đoạn α - peptide cho phép xác định các thể chuyển nạp hay không chuyển nạp bằng cách sàng lọc màu sắc xanh/trắng trên đĩa thạch.

Vectơ chứa một số lớn vị trí cắt của Enzyme giới hạn trong vùng đa chọn lọc MCR (MCR = Multiple Cloning Region). Vị trí MCR của Vectơ pGEM - T easy nằm dọc theo các vị trí nhận biết của Enzyme EcoRI, cho phép 3 Enzyme riêng rẽ cắt đoạn chèn. Vùng lựa chọn của Vectơ pGEM - T easy nằm dọc theo các vị trí nhận biết của EcoRI. Cuối cùng, một vị trí cắt đôi có thể đƣợc sử dụng để giải phóng đoạn chèn từ vectơ này hay vectơ khác.

Vectơ đƣợc cung cấp với đệm 2x rapid ligation buffer. Phản ứng gắn có thể đƣợc ủ trong vòng 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Khoảng thời gian ủ có thể tăng

thêm để tăng số lƣợng khuẩn lạc đƣợc biến nạp. Thông thƣờng ủ qua đêm ở 40C cho số lƣợng thể biến nạp cao nhất.

Hình 1.8. Vectơ tách dòng pGEM - T easy

Bảng 1.3. Các điểm trình tự tham khảo của vectơ pGEM - T easy

Vị trí khởi đầu phiên mã nhờ T7 RNA polymerase 1

Vùng đa nối 10 - 113

Promoter SP6 RNA polymerase (-17 đến +3) 124 - 143 Vị trí khởi đầu phiên mã bằng SP6 RNA polymerase 126 Vị trí liên kết mồi có trình tự đảo ngƣợc pUC/ M13 161 - 177 Bộ ba mở đầu của gen LacZ 165 Operator gen Lac 185 - 201 Vùng mã hóa beta- lactamase 1322 - 2182 Vùng phage f1 2365 - 2820 Trình tự Operon Lac 2821 - 2981,

151 - 380 Vị trí liên kết với mồi có trình tự xuôi pUC/ M13 2941 - 2957 Promoter của T7 RNA polymerase (-17 đến +3) 2984 - 3

PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu

2.1.1. Sinh phẩm

- Mẫu đất, mẫu lá đƣợc thu thập từ Nha Trang và mẫu đất thu thập tại Quảng Nam đƣợc nhận từ phòng Di truyền vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Ấu trùng và Mọt thóc đỏ (Tribolium castaneum) trƣởng thành do phòng Di truyền Vi sinh vật cung cấp.

- Các kit huyết thanh miễn dịch để phân loại đến dƣới loài của Bt do phòng Di truyền Vi sinh vật cung cấp.

- Các cặp mồi đƣợc sử dụng để khuyếch đại gen cry3A.

3AF1 GTG CCA ACT AAC CAT GTT CA

3AR1 TCC TAT GCT TGG TCT AGT TG

- Vector tách dòng plasmid pGEM - T Easy.

- Enzym: Enzyme giới hạn EcoRI, Enzyme nối T4 - ligase, Taq - polymerase…

2.1.2. Hoá chất và thiết bị Hoá chất: Hoá chất:

- Hoá chất sử dụng trong phân lập và nuôi cấy: Agar, cao thịt, cao nấm men, pepton, NaCl, bacto agar…

- Hoá chất sử dụng nhuộm bào tử và tinh thể: fushin bazơ.

- Hoá chất sử dụng trong điện di: Agarose, SDS, Tris - base, TAE,…

- Hoá chất sử dụng trong phản ứng PCR: dNTP, Taq, Buffer, Nƣớc khử ion,…

Thiết bị:

Tên thiết bị Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất

Box cấy Esco Singapo

Tủ ấm OSI Pháp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Máy lắc ổn nhiệt Gerharat Liên Xô cũ Máy ly tâm lạnh Fresco Đức

Máy vortex IKA Đức

Kính hiển vi quang học Olympus Nhật Tủ lạnh sâu Frigo Đan mạch Máy điện di Amersham Pharmacia

Biotech

Thụy Điển Máy PCR PTC – 100 Mỹ

Máy đo pH Thermo Mỹ Máy khuấy từ Velp Europe Máy soi chụp ảnh Gel BioRad Mỹ Bể ổn nhiệt Memmert Đức Tủ sấy khô Modulyo Anh

Ngoài ra chúng tôi cũng sử dụng một số dụng cụ khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu nhƣ: Đĩa petri, bình tam giác, Effendoft, pipet, đầu côn, ống fancol, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, giấy bạc, nhiệt kế, ...

2.1.3. Môi trƣờng

Trong quá trình thực hiện thí nghiệm chúng tôi đã sử dụng các loại môi trƣờng sau:

1. Môi trƣờng MPA:

Cao thịt: 3 g NaCl: 5 g Peptone: 10 g H2O: 1 lít Agar: 20 g pH: 7-7,2

2. Môi trƣờng lỏng MPB: Cao thịt: 3 g H2O: 1 lít Peptone: 10 g pH: 7-7,2 NaCl: 5 g 3. Môi trƣờng Craige Cao thịt: 3 g NaCl: 5 g Peptone: 10 g H2O: 1 lít Bacto agar: 8 g pH: 7-7,2 4. Môi trƣờng LB lỏng Yeast extract: 5 g H2O: 1 lít NaCl : 10 g pH: 7-7,2 Trypton : 10 g 2.1.4. Dung dịch Thuốc nhuộm:

- Thuốc nhuộm bào tử (fushin axit) Fushin axit 1 g H20 cất 100 ml -Thuốc nhuộm tinh thể (fushin bazơ)

Fushin bazơ 0,1 g Etanol 95% 10 ml Phenol 3% 90%

Các dung dịch dùng trong phản ứng PCR và điện di agarose

- Dung dịch TE

Tris HCl 10 mM, pH = 8,0 EDTA 1 mM, pH = 8,0. - Dung dịch đệm điện di TAE 50X

Tris bazơ 121 g Axit acetic 5 M 28,6 ml EDTA 0,5 M pH = 8,0 50 ml Nƣớc khử ion đủ 500 ml

Tris HCl 1 M pH=8,0 1 ml EDTA 0,5 M pH=8,0 2 ml Glycerol 2 ml Bromphenol blue1% 2 ml

- Gel điện di agarose 1%: Agarose 1 g, TAE 1X 100 ml.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập

Bacillus thuringiensis đƣợc phân lập từ các mẫu đất theo phƣơng pháp của Ohba Aiawa, 1986.

Các mẫu đất đƣợc thu thập bằng cách dùng dao vô trùng cạo bề mặt đất và lấy 50 g ở độ sâu 3 – 5 cm, cho vào túi nilon, dán kín. Các mẫu sau khi lấy đƣợc bảo quản ở 4ºC cho đến khi sử dụng.

Cân 10 g đất cho vào bình tam giác, bổ sung 90 ml nƣớc cất vô trùng, lắc 220 vòng/phút trong 30 phút.

Lấy 1 ml dịch đất đã lắc cho vào ống eppendorf, sốc nhiệt 65ºC – 70ºC trong 10 phút.

Pha loãng dịch theo các nồng độ từ 10-1

đến 10-4. Hút 100 μl dịch pha loãng ở 2 nồng độ 10-3

và 10-4 trang đều trên đĩa petri có chứa môi trƣờng MPA sau đó nuôi ở 28ºC.

Sau 72 giờ nuôi cấy, chọn những khuẩn lạc có hình thái bên ngoài thuộc nhóm Bacillus để làm tiêu bản, nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm fucsin base. Quan sát hình thái tế bào, bào tử, tinh thể trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100x (ở vật kính dầu).

2.2.2. Phƣơng pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Phƣơng pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh đƣợc dựa trên đặc tính huyết thanh học của chủng Bt. Đặc tính huyết thanh học đƣợc xác định dựa trên kháng nguyên tiêm mao H và đƣợc tiến hành bằng phản ứng ngƣng kết các tế bào sinh dƣỡng với kháng huyết thanh tƣơng ứng. Phƣơng pháp này cho phép xác định dƣới loài Bt, tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn các chủng

ngƣng kết huyết thanh phải là các chủng có khả năng chuyển động. Do vậy, trƣớc khi tiến hành phƣơng pháp này, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng chuyển động trên môi trƣờng MT3.

Cách tiến hành: Các chủng Bt đƣợc cấy vào trong ống Craige (là ống thủy tinh nhỏ, đƣợc cắm thẳng đứng vào môi trƣờng Craige chứa trong ống nghiệm to), nuôi ở 37oC trong 24 - 28 giờ. Khi đó, những tế bào có khả năng chuyển động sẽ di chuyển lên phía trên bề mặt môi trƣờng, giữa ống Craige và ống nghiệm. Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ dƣợc cấy vào ống nghiệm có chứa 2 ml môi trƣờng MT2, lắc ở 70 - 75 vòng/phút trong khoảng thời gian 12 - 15 giờ.

Phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh tƣơng ứng đƣợc quan sát trên kính hiển vi: Lấy 2 µl dịch nuôi nhỏ lên phiến kính lõm để kiểm tra khả năng chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2 µl huyết thanh chuẩn (đã pha loãng) và quan sát dƣới kính hiển vi.

2.2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.3.1. Định lƣợng mật độ bào tử, tinh thể 2.2.3.1. Định lƣợng mật độ bào tử, tinh thể

Sinh khối đƣợc xử lý nhiệt ở 70oC trong 10 phút. Sau đó đem pha loãng ở các nồng độ 10-6

đến 10-7, lấy 100 µl mỗi nồng độ pha loãng đƣợc cấy thảm trên đĩa petri chứa môi trƣờng MPA. Nuôi ở 28o

C sau 24 giờ, đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có độ pha loãng nhỏ nhất. từ đó số lƣợng bào tử đƣợc tính theo công thức:

CFU= n.a.10

(CFU - Colony forming unit: đơn vị hình thành khuẩn lạc là số lƣợng bào tử trong 1 ml dịch nuôi cấy).

n: số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100 µl dịch pha loãng. a: nồng độ pha loãng.

2.2.3.2. Thử hoạt tính trên đối tƣợng mọt thóc đỏ

Sử dụng các con mọt thóc đỏ, chúng tôi tiến hành thử nghiệm theo phƣơng pháp của Thiery và Frachon ở 2 nồng độ 107

nồng độ thử nghiệm với 10 con mọt thóc đỏ (ấu trùng và trƣởng thành) trên đĩa mỗi nồng độ 3 đĩa.

Chuẩn bị:

- Các chủng Bt sẽ đƣợc cấy thảm trên môi trƣờng MPA, nuôi ở 280C trong 72 giờ. Cho 1,5 ml nƣớc cất vô trùng và gạt lấy dịch cho vào effendorf. Sau đó tiến hành pha loãng đến mật độ 107 và 109 bào tử/ml để thử hoạt tính.

- Bột ngô đƣợc sấy ở nhiệt độ 500C với thời gian 60 - 90 phút. Cân 1 g bột ngô cho vào đĩa pettri, sau đó cho vào 1 ml dịch pha loãng ở trên, trộn đều và để khô. Cho 10 con mọt thóc đỏ vào, theo dõi và sau 24 giờ thì kiểm tra số lƣợng mọt và ấu trùng chết. Thời gian thử hoạt tính là 5 ngày, cùng với mẫu thử nghiệm chúng tôi cũng tiến hành làm các mẫu đối chứng để so sánh.

Sau khi kết thúc thí nghiệm thì xác định tỷ lệ mọt chết theo công thức Abbott:

A = ( C – T)/ C.100

A: % mọt chết

C: Số mọt sống sót ở mẫu đối chứng T: Số mọt sống ở mẫu thí nghiệm

2.2.4. Phƣơng pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn Bt

- Nuôi vi khuẩn Bt qua đêm trong môi trƣờng MPB, ở 370C lắc ở 200 vòng/phút.

- Lấy 1,5 ml dịch nuôi, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút. - Loại dịch nổi thu cặn.

- Bổ sung 150 µl Sol I, vontex làm tan tủa. - Bổ sung 150 µl Sol II, đảo nhẹ tay.

- Bổ sung 150 µl Sol III, đảo nhẹ.

- Ly tâm 10000 vòng/phút ( 40C, 10 phút), thu dịch nổi vào ống effendorf mới. - Bổ sung 1 ml cồn tuyệt đối tủa ở -200C ít nhất trong 1 giờ (tốt nhất là 4 giờ). - Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa.

- Làm khô.

- Hòa tủa trong 45 µl RNA ủ 370C trong 1 giờ. - Bảo quản ở - 200C.

2.2.5. Phƣơng pháp PCR để khuyếch đại gen cry3A (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Phƣơng pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát hiện năm 1985. Nhờ enzyme DNA polymerase xúc tác, trên các mạch khuôn DNA tổng hợp nên các mạch đơn mới.Các mạch đơn mới đƣợc tổng hợp lại đƣợc sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp mạch mới ở chu kỳ tiếp theo. Sự tổng hợp mạch đơn DNA mới cần có sự tham gia của DNA mồi tạo các nhóm 3‟OH tự do. Các nucleotide đƣợc gắn ở vị trí nhóm OH kéo dài tạo thành mạch đơn mới.

Thành phần của phản ứng PCR:  Buffer 10X có Mg2+ 2 µl  dNTPs 2 µl  Mồi Col 2A 1 µl  Mồi Col 2B 1 µl  DNA temp 2 µl  Taq 0,2 µl

 H2O khử ion vô trùng 12,8 µl

Chu trình nhiệt của phản ứng khuyếch đại gen cry3A:

1. Biến tính DNA ở 950 C trong 2 phút. 2.Tổng hợp (30 chu kỳ lặp lại):  Biến tính: 950 C trong 1 phút.  Gắn mồi: 500 C trong 1 phút.

 Kéo dài chuỗi: 720

C trong 1 phút. 3. Tổng hợp bổ sung ở 720

C trong 10 phút. 4. Bảo quản ở 40

C.

Sản phẩm của phẩn ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%.

2.2.6. Phƣơng pháp tách dòng gen cry3A

2.2.6.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM - T Easy

Sản phẩm PCR đƣợc gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng nhờ Enzyme nối T4 - ligase.

Thành phần của quá trình gắn gen vào vectơ:

 2X ligation buffer 5 µl

 Vectơ: pGEM - T Easy 1 µl

 Enzyme nối T4 - ligase 1 µl

 PCR product 5 µl

Quá trình nối ghép đƣợc tiến hành 14 – 16 giờ ở 40C.

Sau khi gắn xong để vào đá cho vào tủ lạnh qua đêm.

2.2.6.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α

Chuẩn bị tế bào khả biến:

 Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong môi trƣờng LB lỏng qua đêm.

 Chuyển 0,5 ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50 ml môi trƣờng LB, lắc 200 vòng/ phút trong 2 giờ ở 370C. Khi đo OD600 đạt 0,5 - 0,6 thì lấy mẫu ra đặt trên đá 1 giờ.

 Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút loại bỏ dịch nổi. Hòa tế bào thu đƣợc trong 50 ml CaCl2 100 mM vô trùng. Mẫu đƣợc ủ 15 phút và ly tâm thu tế bào ở 6000 vòng/phút.

 Hòa lại tủa trong 25 ml CaCl2 100 mM, bổ sung 15% glycerol.

 Hút 10 µl dịch tế bào vào mỗi ống eppendorf và bảo quản -800C.

Quy trình biến nạp:

 Bổ sung 5 µl sản phẩm lai vào E. coli đã làm tế bào khả biến.

 Ủ đá trong 30 phút nhằm tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vectơ tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 Sốc nhiệt ở 420C (60 - 90s), sau đó giữ hỗn hợp này trong đá 2 phút.

 Bổ sung 300 µl môi trƣờng LB, lắc ở 370C , 200 vòng/phút trong 1 - 1,5 giờ.

 Hút 150 µl sản phẩm trong vào đĩa Petri có chứa môi trƣờng LBA có bổ sung kháng sinh ampicillin + Xgal nuôi ở 370C trong 14 - 16 giờ.

2.2.6.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid của vi khuẩn E.coli DH5α

 Lấy khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp (chọn khuẩn lạc trắng) cấy vào 5 ml LB có chứa chất kháng sinh ampicilin, nuôi lắc qua đêm ở 370C, 200 vòng/phút.

 Lấy 1,5 ml dịch nuôi, ly tâm 6000vòng/phút trong 10 phút.

 Loại dịch nổi thu cặn.

 Bổ sung 150 µl Sol I, votex làm tan tủa.

 Bổ sung 150 µl Sol II, đảo nhẹ tay.

 Bổ sung 150 µl Sol III, đảo nhẹ.

 Ly tâm 10.000 vòng/phút( 40C, 10 phút), thu dịch nổi vào ống effendorf mới.

 Bổ sung 1ml cồn tuyệt đối tủa ở -200C ít nhất trong 1 giờ (tốt nhất là 4 giờ).

 Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa.

 Làm khô và hòa tủa trong 45 µl RNA ủ trong tủ 370C trong 1 giờ.

 Đẩy nƣớc tới 500 µl.

 Bổ sung chloroform: Isoamylalcohol (24:1) tỷ lệ 1:1

 Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.

 Thu dịch nổi

 Bổ sung NaOAC/ KOAC (1:10), sau đó tiếp tục bổ sung cồn 100% tỷ lệ 2,5:1

 Ủ ở tủ -20o

C ít nhất trong 4 giờ.

 Rửa tủa bằng cồn 70% (200 µl)

 Ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút, thu tủa.

 Làm khô

 Hòa tủa trong 45 µl nƣớc.

2.2.6.4. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn EcoRI