2.2.1. Phƣơng pháp phân lập
Bacillus thuringiensis đƣợc phân lập từ các mẫu đất theo phƣơng pháp của Ohba Aiawa, 1986.
Các mẫu đất đƣợc thu thập bằng cách dùng dao vô trùng cạo bề mặt đất và lấy 50 g ở độ sâu 3 – 5 cm, cho vào túi nilon, dán kín. Các mẫu sau khi lấy đƣợc bảo quản ở 4ºC cho đến khi sử dụng.
Cân 10 g đất cho vào bình tam giác, bổ sung 90 ml nƣớc cất vô trùng, lắc 220 vòng/phút trong 30 phút.
Lấy 1 ml dịch đất đã lắc cho vào ống eppendorf, sốc nhiệt 65ºC – 70ºC trong 10 phút.
Pha loãng dịch theo các nồng độ từ 10-1
đến 10-4. Hút 100 μl dịch pha loãng ở 2 nồng độ 10-3
và 10-4 trang đều trên đĩa petri có chứa môi trƣờng MPA sau đó nuôi ở 28ºC.
Sau 72 giờ nuôi cấy, chọn những khuẩn lạc có hình thái bên ngoài thuộc nhóm Bacillus để làm tiêu bản, nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm fucsin base. Quan sát hình thái tế bào, bào tử, tinh thể trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100x (ở vật kính dầu).
2.2.2. Phƣơng pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh
Phƣơng pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh đƣợc dựa trên đặc tính huyết thanh học của chủng Bt. Đặc tính huyết thanh học đƣợc xác định dựa trên kháng nguyên tiêm mao H và đƣợc tiến hành bằng phản ứng ngƣng kết các tế bào sinh dƣỡng với kháng huyết thanh tƣơng ứng. Phƣơng pháp này cho phép xác định dƣới loài Bt, tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn các chủng
ngƣng kết huyết thanh phải là các chủng có khả năng chuyển động. Do vậy, trƣớc khi tiến hành phƣơng pháp này, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng chuyển động trên môi trƣờng MT3.
Cách tiến hành: Các chủng Bt đƣợc cấy vào trong ống Craige (là ống thủy tinh nhỏ, đƣợc cắm thẳng đứng vào môi trƣờng Craige chứa trong ống nghiệm to), nuôi ở 37oC trong 24 - 28 giờ. Khi đó, những tế bào có khả năng chuyển động sẽ di chuyển lên phía trên bề mặt môi trƣờng, giữa ống Craige và ống nghiệm. Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ dƣợc cấy vào ống nghiệm có chứa 2 ml môi trƣờng MT2, lắc ở 70 - 75 vòng/phút trong khoảng thời gian 12 - 15 giờ.
Phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh tƣơng ứng đƣợc quan sát trên kính hiển vi: Lấy 2 µl dịch nuôi nhỏ lên phiến kính lõm để kiểm tra khả năng chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2 µl huyết thanh chuẩn (đã pha loãng) và quan sát dƣới kính hiển vi.
2.2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.3.1. Định lƣợng mật độ bào tử, tinh thể 2.2.3.1. Định lƣợng mật độ bào tử, tinh thể
Sinh khối đƣợc xử lý nhiệt ở 70oC trong 10 phút. Sau đó đem pha loãng ở các nồng độ 10-6
đến 10-7, lấy 100 µl mỗi nồng độ pha loãng đƣợc cấy thảm trên đĩa petri chứa môi trƣờng MPA. Nuôi ở 28o
C sau 24 giờ, đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có độ pha loãng nhỏ nhất. từ đó số lƣợng bào tử đƣợc tính theo công thức:
CFU= n.a.10
(CFU - Colony forming unit: đơn vị hình thành khuẩn lạc là số lƣợng bào tử trong 1 ml dịch nuôi cấy).
n: số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100 µl dịch pha loãng. a: nồng độ pha loãng.
2.2.3.2. Thử hoạt tính trên đối tƣợng mọt thóc đỏ
Sử dụng các con mọt thóc đỏ, chúng tôi tiến hành thử nghiệm theo phƣơng pháp của Thiery và Frachon ở 2 nồng độ 107
nồng độ thử nghiệm với 10 con mọt thóc đỏ (ấu trùng và trƣởng thành) trên đĩa mỗi nồng độ 3 đĩa.
Chuẩn bị:
- Các chủng Bt sẽ đƣợc cấy thảm trên môi trƣờng MPA, nuôi ở 280C trong 72 giờ. Cho 1,5 ml nƣớc cất vô trùng và gạt lấy dịch cho vào effendorf. Sau đó tiến hành pha loãng đến mật độ 107 và 109 bào tử/ml để thử hoạt tính.
- Bột ngô đƣợc sấy ở nhiệt độ 500C với thời gian 60 - 90 phút. Cân 1 g bột ngô cho vào đĩa pettri, sau đó cho vào 1 ml dịch pha loãng ở trên, trộn đều và để khô. Cho 10 con mọt thóc đỏ vào, theo dõi và sau 24 giờ thì kiểm tra số lƣợng mọt và ấu trùng chết. Thời gian thử hoạt tính là 5 ngày, cùng với mẫu thử nghiệm chúng tôi cũng tiến hành làm các mẫu đối chứng để so sánh.
Sau khi kết thúc thí nghiệm thì xác định tỷ lệ mọt chết theo công thức Abbott:
A = ( C – T)/ C.100
A: % mọt chết
C: Số mọt sống sót ở mẫu đối chứng T: Số mọt sống ở mẫu thí nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.4. Phƣơng pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn Bt
- Nuôi vi khuẩn Bt qua đêm trong môi trƣờng MPB, ở 370C lắc ở 200 vòng/phút.
- Lấy 1,5 ml dịch nuôi, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút. - Loại dịch nổi thu cặn.
- Bổ sung 150 µl Sol I, vontex làm tan tủa. - Bổ sung 150 µl Sol II, đảo nhẹ tay.
- Bổ sung 150 µl Sol III, đảo nhẹ.
- Ly tâm 10000 vòng/phút ( 40C, 10 phút), thu dịch nổi vào ống effendorf mới. - Bổ sung 1 ml cồn tuyệt đối tủa ở -200C ít nhất trong 1 giờ (tốt nhất là 4 giờ). - Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa.
- Làm khô.
- Hòa tủa trong 45 µl RNA ủ 370C trong 1 giờ. - Bảo quản ở - 200C.
2.2.5. Phƣơng pháp PCR để khuyếch đại gen cry3A
Phƣơng pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát hiện năm 1985. Nhờ enzyme DNA polymerase xúc tác, trên các mạch khuôn DNA tổng hợp nên các mạch đơn mới.Các mạch đơn mới đƣợc tổng hợp lại đƣợc sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp mạch mới ở chu kỳ tiếp theo. Sự tổng hợp mạch đơn DNA mới cần có sự tham gia của DNA mồi tạo các nhóm 3‟OH tự do. Các nucleotide đƣợc gắn ở vị trí nhóm OH kéo dài tạo thành mạch đơn mới.
Thành phần của phản ứng PCR: Buffer 10X có Mg2+ 2 µl dNTPs 2 µl Mồi Col 2A 1 µl Mồi Col 2B 1 µl DNA temp 2 µl Taq 0,2 µl
H2O khử ion vô trùng 12,8 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng khuyếch đại gen cry3A:
1. Biến tính DNA ở 950 C trong 2 phút. 2.Tổng hợp (30 chu kỳ lặp lại): Biến tính: 950 C trong 1 phút. Gắn mồi: 500 C trong 1 phút.
Kéo dài chuỗi: 720
C trong 1 phút. 3. Tổng hợp bổ sung ở 720
C trong 10 phút. 4. Bảo quản ở 40
C.
Sản phẩm của phẩn ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%.
2.2.6. Phƣơng pháp tách dòng gen cry3A
2.2.6.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM - T Easy
Sản phẩm PCR đƣợc gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng nhờ Enzyme nối T4 - ligase.
Thành phần của quá trình gắn gen vào vectơ:
2X ligation buffer 5 µl
Vectơ: pGEM - T Easy 1 µl
Enzyme nối T4 - ligase 1 µl
PCR product 5 µl
Quá trình nối ghép đƣợc tiến hành 14 – 16 giờ ở 40C.
Sau khi gắn xong để vào đá cho vào tủ lạnh qua đêm.
2.2.6.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩn bị tế bào khả biến:
Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong môi trƣờng LB lỏng qua đêm.
Chuyển 0,5 ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50 ml môi trƣờng LB, lắc 200 vòng/ phút trong 2 giờ ở 370C. Khi đo OD600 đạt 0,5 - 0,6 thì lấy mẫu ra đặt trên đá 1 giờ.
Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút loại bỏ dịch nổi. Hòa tế bào thu đƣợc trong 50 ml CaCl2 100 mM vô trùng. Mẫu đƣợc ủ 15 phút và ly tâm thu tế bào ở 6000 vòng/phút.
Hòa lại tủa trong 25 ml CaCl2 100 mM, bổ sung 15% glycerol.
Hút 10 µl dịch tế bào vào mỗi ống eppendorf và bảo quản -800C.
Quy trình biến nạp:
Bổ sung 5 µl sản phẩm lai vào E. coli đã làm tế bào khả biến.
Ủ đá trong 30 phút nhằm tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vectơ tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều.
Sốc nhiệt ở 420C (60 - 90s), sau đó giữ hỗn hợp này trong đá 2 phút.
Bổ sung 300 µl môi trƣờng LB, lắc ở 370C , 200 vòng/phút trong 1 - 1,5 giờ.
Hút 150 µl sản phẩm trong vào đĩa Petri có chứa môi trƣờng LBA có bổ sung kháng sinh ampicillin + Xgal nuôi ở 370C trong 14 - 16 giờ.
2.2.6.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid của vi khuẩn E.coli DH5α
Lấy khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp (chọn khuẩn lạc trắng) cấy vào 5 ml LB có chứa chất kháng sinh ampicilin, nuôi lắc qua đêm ở 370C, 200 vòng/phút.
Lấy 1,5 ml dịch nuôi, ly tâm 6000vòng/phút trong 10 phút.
Loại dịch nổi thu cặn.
Bổ sung 150 µl Sol I, votex làm tan tủa.
Bổ sung 150 µl Sol II, đảo nhẹ tay.
Bổ sung 150 µl Sol III, đảo nhẹ.
Ly tâm 10.000 vòng/phút( 40C, 10 phút), thu dịch nổi vào ống effendorf mới.
Bổ sung 1ml cồn tuyệt đối tủa ở -200C ít nhất trong 1 giờ (tốt nhất là 4 giờ).
Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa.
Làm khô và hòa tủa trong 45 µl RNA ủ trong tủ 370C trong 1 giờ.
Đẩy nƣớc tới 500 µl.
Bổ sung chloroform: Isoamylalcohol (24:1) tỷ lệ 1:1
Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.
Thu dịch nổi
Bổ sung NaOAC/ KOAC (1:10), sau đó tiếp tục bổ sung cồn 100% tỷ lệ 2,5:1
Ủ ở tủ -20o
C ít nhất trong 4 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Rửa tủa bằng cồn 70% (200 µl)
Ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút, thu tủa.
Làm khô
Hòa tủa trong 45 µl nƣớc.
2.2.6.4. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn EcoRI
Để xác định chính xác vector tái tổ hợp có mang đoạn gen mong muốn hay không tiến hành cắt đoạn DNA đã ghép nối vào plasmide bằng EcoRI.
Thành phần phản ứng:
EcoRI 1 µl Buffer 1 µl DNA plasmide 3 µl dH2O 5 µl
Quá trình cắt đƣợc tiến hành ở 370C trong 4 giờ.
2.2.6.5. Xác định trình tự nucleotide của đoạn gen đã tách dòng
Tiến hành theo phƣơng pháp tổng hợp của Sanger và cộng sự. Thực hiện phản ứng PCR ngoài các thành phần thông thƣờng còn bổ sung thêm 4 loại dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, dd TTP) và đƣợc đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang.
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide bổ sung ure để làm tăng độ phân giải của gen. Sử dụng tia laze quét phát hiện dideoxynucleotide đã đánh dấu.
Xử lý kết quả bằng máy đọc trình tự DNA tự động, sau đó so sánh trình tự gen đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen quốc tế.
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis mang gen cry3A có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh cứng. gen cry3A có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh cứng.
3.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Để tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh cứng, chúng tôi tiến hành phân lập 15 mẫu đất, mẫu lá ở Nha Trang và 10 mẫu đất ở trạm xã Đặng Thùy Trâm - Quảng Nam đƣợc cung cấp bởi phòng di truyền vi sinh vật thuộc viện công nghệ sinh học.
Từ các mẫu đất đƣợc nhận chúng tôi tiến hành phân lập. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 280C, trên đĩa thạch có chứa môi trƣờng MPA thấy mọc lên nhiều loại khuẩn lạc khác nhau trong đó chủ yếu là khuẩn lạc thuộc các loài Bacillus.
Khuẩn lạc giống Bt là những khuẩn lạc tròn, có màu trắng sữa, có mép nhăn hoặc không.
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trƣờng MPA phân lập từ đất Nha Trang nuôi cấy ở 280
C sau 3 ngày
Từ các khuẩn lạc riêng rẽ có hình dạng giống Bt chúng tôi tiến hành làm tiêu bản và nhuộm với thuốc nhuộm fushin, quan sát dƣới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần để kiểm tra khả năng hình thành bào tử và tinh thể.
Bảng 3.1. Kết quả phân lập Bacillus thuringiensis trong các mẫu đất STT Địa phƣơng Chủng Bt
1 Quảng Nam 15 2 Nha Trang 20 Tổng 35
Kết quả cho thấy, từ các mẫu đất từ Quảng Nam và Nha Trang chúng tôi đã xác định đƣợc 35 chủng Bacillus thuringiensis hình thành bào tử vàsinh tinh thể. Sau khi phân lập, chúng tôi tiến hành xác định hình dạng tinh thể của các chủng phân lập.
3.1.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis có khả năng sinh ra các dạng tinh thể: hình cầu, hình lƣỡng tháp, hình lập phƣơng và hình không xác định. Các chủng khác nhau có khả năng sinh ra tinh thể có hình dạng khác nhau.
Bằng phƣơng pháp quan sát trên kính hiển vi quang học với tiêu bản nhuộm fushin, chúng tôi đã phân loại đƣợc hình dạng tinh thể khác nhau của 35 chủng Bt phân lập (hình 3.2, bảng 3.2).
Hình 3.2. Hình dạng tinh thể của chủng Bt ĐNT9.5 khi nhuộm fushin và soi dƣới kính hiển vi quang học
1: Tinh thể 2: Bào tử 3: Tế bào 1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 2
Bảng 3.2 Hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập TT Địa phƣơng Hình dạng tinh thể Hình lập phƣơng Hình cầu Hình lƣỡng tháp Hình không xác định Số chủn g % Số chủn g % Số chủn g % Số chủn g % 1 Quảng Nam 3 8,5 3 8,5 7 20 2 5,9 2 Nha Trang 8 22,9 5 14,3 4 11,4 3 8,5 Tổng số 11 31,4 8 22,8 11 31.4 5 14,4
Từ 35 chủng phân lập, sau khi quan sát dƣới kính hiển vi chúng tôi đã thu đƣợc 11 chủng mang tinh thể hình lập phƣơng chiếm 31,4%, 8 chủng mang tinh thể hình cầu chiếm 22,8%, 11 chủng mang tinh thể hình lƣỡng tháp chiếm 31.4% và 5 chủng còn lại mang tinh thể có hình không xác định chiếm 14,4%. Qua đó, thấy ở các mẫu đất Quảng Nam và Nha Trang Bt sinh tinh thể có hình lƣỡng tháp và hình lập phƣơng chiếm tỷ lệ cao nhất 31.4% và các chủng mang tinh thể hình không xác định chiếm tỷ lệ thấp nhất với 14,4%. Theo các tài liệu công bố, các chủng mang gen cry3A chủ yếu có dạng tinh thể hình lập phƣơng thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis.
3.2. Kết quả phân loại dƣới loài bằng phƣơng pháp huyết thanh
Loài B. thuringiensis đƣợc chia làm rất nhiều dƣới loài khác nhau, mỗi dƣới loài mang các đặc điểm riêng biệt.Để khẳng định chính xác 11 chủng sinh tinh thể lập phƣơng có thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp.
tenebrionisi hay không, chúng tôi tiến hành sàng lọc các chủng Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis từ 11 chủng nói trên bằng phƣơng pháp huyết thanh học đã trình bày ở mục 2.2.2 phần vật liệu phƣơng pháp. Các chủng
Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis sẽ ngƣng kết với typ huyết thanh
Hình 3.3. Hình ảnh ngƣng kết của chủng ĐNT 9.5 phân lập với type huyết thanh dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần
A: trƣớc khi nhỏ huyết thanh B: sau khi nhỏ huyết thanh (các tế bàongƣng kết lại thành từng đám)
Kết quả phân loại dƣới loài huyết thanh cho thấy, trong số 11 chủng mang tinh thể hình lập phƣơng có 9 chủng ngƣng kết với type huyết thanh
tenebrionis điều đó chứng tỏ 9 chủng này có khả năng thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis.
3.3. Hoạt tính diệt mọt thóc đỏ 3.3.1. Xác định nồng độ bào tử 3.3.1. Xác định nồng độ bào tử
Trƣớc khi tiến hành thử hoạt tính diệt mọt thóc đỏ, chúng tôi tiến hành xác định nồng độ bào tử của các chủng Bt có khả năng thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis phân lập đƣợc tại đất Quảng Nam và Nha