của vi khuẩn Salmonella bằng phản ứng PCR
- Chuẩn bị DNA:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
máu ở 37oC trong 24 giờ. Lấy 1 Ờ 2 khuẩn lạc hòa vào 300 ộl nước khử ion vô trùng. đun cách thủy ở 100oC trong 15 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút phần dịch nổi có chứa DNA ựể làm phản ứng PCR.
- Tiến hành phản ứng PCR:
Thực hiện phản ứng PCR ựơn phức với mỗi phản ứng sử dụng một cặp mồi ựặc hiệu ựể xác ựịnh một loại gen kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ựược. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 cặp mồi khác nhau ựể xác ựịnh 2 loại gen kháng kháng sinh của các chủng
Salmonella, ựó là gen β-lactamase TEM (blaTEM) kháng ampicillin và gen
tetA(A) kháng tetracyclin. Trình tự nucleotide của 2 cặp mồi và kắch thước sản phẩm PCR tương ứng của chúng như ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi và kắch thước sản phẩm PCR tương ứng
Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide Sản phẩm
blaTEM-F 5'-GCACGAGTGGGTTACATCGA-3'
blaTEM-R 5'- GGTCCTCCGATCGTTGTCAG-3' 310 bp
tetA(A)-F 5'-GCTACATCCTGCTTGCCTTC-3'
tetA(A)-R 5'- CATAGATCGCCGTGAAGAGG-3' 210 bp Thành phần của phản ứng PCR bao gồm: 1X PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 0.2 uM mỗi loại primer, 0.05 ul Taq DNA polymerase, 1 ul DNA template và nước cất vừa ựủ 25 ul.
điều kiện của phản ứng PCR gồm các bước: Tiền biến tắnh ở 95ỨC/5 phút, sau ựó là 30 chu kỳ gồm biến tắnh ở 950C/ 1 phút, bắt cặp mồi ở 54ỨC/ 1 phút (với blaTEM) hoặc 58ỨC/ 1 phút (với tetA(A)), tổng hợp ở 72ỨC/ 1 phút và cuối cùng là kéo dài ở 72ỨC/ 7 phút.
Sản phẩm PCR sau ựó ựược ựiện di trên thạch agarose gel 1%, nhuộm bằng ethidium bromide và dùng ựọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc 2000 (bio- rad).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
đọc KQ bằng cách quan sát dưới ựèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Palaroid camerạ Sản phẩm PCR của Salmonella theo dõi là 310 bp, 210 bp.