3.4.1 Phương pháp lấy mẫu
Mẫu thịt lợn và mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn ựược lấy ngẫu nhiên tại một số chợ trên ựịa bàn Hà nộị Mẫu ựược lấy vào buổi sáng. Mỗi mẫu ựược ựựng riêng rẽ vào 1 túi nilon sạch vô trùng, có ghi rõ ký hiệu mẫụ Trên mỗi bàn thịt lấy 01 mẫu thịt lợn (30gram) và 01 mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn.
Lấy mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn: dùng miếng gạc vô trùng lau bàn bán thịt lợn, dao, thớt.
Các mẫu ựược bảo quản trong nhiệt ựộ lạnh (4-8oC) và chuyển về phòng thắ nghiệm ựể xử lý mẫu trong cùng ngàỵ
3.4.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella
Tiến hành nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella dựa trên cơ sở quy trình phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Salmonella của Khoa Thú y ứng dụng và Thú y cộng ựồng, Trường đại học Nông Nghiệp và Thú y Obihiro, Nhật Bản, với một số cải tiến ựể phù hợp với ựiều kiện phòng thắ nghiệm tại Việt Nam. Quy trình phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Salmonella từ các mẫu bệnh phẩm ựược tóm tắt theo sơ ựồ 3.1.
3.4.3 Phương pháp giám ựịnh vi khuẩn Salmonella phân lập ựược
Bao gồm các phương pháp sau:
- Kiểm tra hình thái học, tắnh chất bắt màu, nhuộm gram
- Kiểm tra khả năng di ựộng trên môi trường lỏng và môi trường thạch - Phản ứng sinh Indol
- Phản ứng Oxidaze - Phản ứng Catalaze
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
3.4.4 Phương pháp xác ựịnh serotyp của vi khuẩn Salmonella phân lập ựược
Xác ựịnh serotyp của các chủng Salmonella phân lập ựược bằng các phản ứng ngưng kết trên phiến kắnh và trong ống nghiệm bằng kháng huyết thanh chuẩn (hãng Denka Seiken Cọ, Ltd. Tokyo, Nhật Bản) ựối với kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông H. Trên cơ sở kết quả thu ựược, tiến hành ựịnh danh chủng vi khuẩn kiểm tra dựa vào bảng phân loại Kauffmann và White (Popoff, 2001).
Sơ ựồ 3.1. Quy trình phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Salmonella từ các mẫu thịt lợn và mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn
Mẫu thịt lợn + Mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn BPW (370C/ 18- 24 h) LIM (370C/ 20- 24 h) (370Malonate C/ 18- 24 h) TSI (370C/ 18- 24 h) Xác ựịnh serotyp Giữ giống RV (420C/ 18- 24 h) DHL (370C/ 20- 24 h) CHROM TMSalmonella (370C/ 20- 24 h)
Phản ứng lên men ựường
Xác ựịnh khả năng mẫn cảm kháng sinh
Xác ựịnh gen mã hoá tắnh kháng kháng sinh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
3.4.4.1 Xác ựịnh nhóm kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh ựa giá nhóm O
Sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh (Slide agglutination) ựể xác ựịnh nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella. đây là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể ựược sử dụng rất phổ biến trong phòng thắ nghiệm ựể chẩn ựoán và giám ựịnh các loại vi khuẩn.
- Chuẩn bị:
+ Khuẩn lạc vi khuẩn ựược nuôi cấy vào thạch TSI hoặc thạch thường ựể tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
+ Kháng huyết thanh chuẩn ựa giá. - Tiến hành:
+ Chia 1 phiến kắnh sạch làm 2 phần: 1 phần làm ựối chứng, và 1 phần làm thắ nghiệm. Nhỏ vào mỗi bên phiến kắnh một giọt nước sinh lý.
+ Lấy một ắt khuẩn lạc Salmonella cần ựịnh typ ựã ựược cấy trên thạch TSI hoặc thạch thường, hòa với mỗi giọt nước muối sinh lý ựã nhỏ sẵn ở hai bên phiến kắnh thành huyễn dịch kháng nguyên.
+ Nhỏ tiếp vào bên thắ nghiệm 1 giọt kháng huyết thanh ựa giá nhóm O, còn bên ựối chứng âm, nhỏ thêm một giọt nước muối sinh lý. Trộn ựều, lắc nhẹ phiến kắnh trong khoảng 30 Ờ 60 giâỵ
+ đọc kết quả: Phản ứng dương tắnh khi có cụm ngưng kết kiểu hạt xuất hiện, huyễn dịch xung quanh trong. Bên ựối chứng âm huyễn dịch vẫn ựục ựềụ
3.4.4.2 Xác ựịnh kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh ựơn giá nhóm O
Chủng cho kết quả dương tắnh với kháng huyết thanh O ựa giá, tiếp tục ựược xác ựịnh với các kháng huyết thanh ựơn giá. Cách làm tương tự như phương pháp ựã ựược trình bày ở phần 3.4.4.1.
3.4.4.3. Xác ựịnh kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella
Sau khi ựã xác ựịnh kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella, tiếp tục tiến hành xác ựịnh kháng nguyên H của chúng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
(i) Xác ựịnh kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 1)
- Chuẩn bị:
+ Chủng vi khuẩn Salmonella cần ựịnh typ ựược cấy trên môi trường thạch TSI hoặc thạch thường, ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
+ Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ, cấy vào môi trường nước BHI (5ml) ựể tủ ấm 37oC trong 2 giờ hoặc qua ựêm ở nhiệt ựộ phòng. Sau ựó, thêm vào canh trùng 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung formalin (nước sinh lý + 1% Formalin) nhằm mục ựắch là ựể cố ựịnh kháng nguyên H.
+ Kháng huyết thanh nhóm H gồm: Ha, Hb, Hc, Hd, He,h, HG, Hi, Hk, HL, Hr, Hy, He,n, H1
- Tiến hành:
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh từ Ha ựến H1 vào mỗi ống nghiệm.
+ Dùng Micropipet, hút 450 ộl canh trùng Salmonella ựã xử lý ở trên và cho vào ống nghiệm ựã có chứa kháng huyết thanh.
+ Lắc nhẹ ựể trộn ựều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống nghiệm, sau ựó ựặt vào bể ủ nhiệt ở nhiệt ựộ 50oC trong 1 giờ.
+ đọc kết quả: Phản ứng dương tắnh thì có ngưng kết kiểu ựám mây, các cụm ngưng kết tương ựối lỏng lẻọ Phản ứng âm tắnh thì dung dịch trong ống nghiệm ựục ựềụ
(ii) Xác ựịnh kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 2)
Sau khi có kết quả xác ựịnh kháng nguyên H pha 1 của các chủng
Salmonella, chúng tôi tiến hành xác ựịnh tiếp kháng nguyên H pha 2 của chúng.
+ Hút 3,5 ml môi trường nước thịt HI hoặc BHI có chứa 0,25% thạch vào trong 1 ống nghiệm có nút vặn, có chứa sẵn 1 ống thủy tinh nhỏ hở 2 ựầụ
+ để ống nghiệm ựó vào bể ủ nhiệt ở 50oC trong 15 phút, sau ựó nhỏ 50 ộl kháng huyết thanh tương ứng với kết quả của pha 1 vào ống nghiệm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
+ Dùng que cấy thẳng, lấy 1 khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần ựịnh typ, cấy thẳng vào phắa trong của ống thủy tinh nhỏ sâu khoảng 1-1,5cm. Sau ựó ủ ở tủ ấm 37oC trong vòng 24 giờ.
+ Lấy 1 vòng que cấy của chủng vi khuẩn ựã phát triển trong môi trường (chủng này có thể di chuyển qua thạch mà không bị ức chế), cấy vào 1 ống nghiệm có chứa 5 ml BHI, ựể nghiêng tuýp trong tủ ấm 37oC trong vòng 6 giờ.
+ Thêm vào ựó 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung formalin (nước muối sinh lý + 1% formalin), ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 2 giờ.
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh tương ứng với kết quả của các chủng tạo pha 2 vào mỗi ống nghiệm.
+ Dùng micropipet hút 450 ộl canh trùng Salmonella ựã xử lý ở trên và cho vào ống nghiệm ựã có chứa kháng huyết thanh.
+ Lắc nhẹ ựể trộn ựều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống nghiệm, sau ựó ựặt vào bể ủ nhiệt ở nhệt ựộ 50oC trong 1 giờ.
+ đọc kết quả: Phản ứng dương tắnh thì có ngưng kết kiểu ựám mây, các cụm ngưng kết tương ựối lỏng lẻọ Phản ứng âm tắnh thì dung dịch trong ống nghiệm ựục ựềụ
3.4.5 Phương pháp xác ựịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh
Kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn Salmonella
theo phương pháp của Kirby- Bauer và ựánh giá kết quả dựa vào bảng ựánh giá kết quả của NCCLS (2000) (Các tiêu chuẩn lâm sàng và phòng thắ nghiệm của Hội ựồng quốc gia Mỹ - National Committee for Clinical Laboratory Standards).
Chúng tôi lựa chọn chủng kháng thuốc có ựường kắnh vòng vô khuẩn rõ ràng ựể kiểm tra sự có mặt của của các gen mã hoá.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
Bảng 3.1. Bảng ựánh giá mức ựộ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh
đường kắnh vòng vô khuẩn (mm) TT Loại kháng sinh Hàm lượng Mẫn cảm cao Mẫn cảm trung bình Kháng thuốc 1 Amikacin 30 ộg ≥ 17 15 Ờ 16 ≤ 14 2 Amoxicillin 20 ộg ≥ 20 0 ≤ 19 3 Ampicillin 10 ộg ≥ 22 12 Ờ 22 ≤ 11 4 Cefotaxime sodium 30 ộg ≥ 24 0 ≤ 24 5 Ceftazidine 30 ộg ≥ 20 15 Ờ 19 ≤ 14 6 Ciprofloxacin 5 ộg ≥ 21 16 Ờ 20 ≤ 15 7 Colistin 10 ộg ≥ 15 13 Ờ 14 ≤ 12 8 Kanamycin 30 ộg ≥ 18 14 Ờ 17 ≤ 13 9 Erythromycin 15 ộg ≥ 21 16 Ờ 20 ≤ 15 10 Gentamycin 10 ộg ≥ 13 0 ≤ 12 11 Lincomycin 15 ộg ≥ 15 13 Ờ 14 ≤ 12 12 Neomycin 30 ộg ≥ 15 13 Ờ 14 ≤ 12 13 Ofloxacin 5 ộg ≥ 16 13 Ờ 15 ≤ 12 14 Rifampicin 30 ộg ≥ 20 17 Ờ 19 ≤ 16 15 Tetracycline 30 ộg ≥ 23 19 Ờ 22 ≤ 18 16 Trimethoprime/ Sulfamethoxazole 25 ộg ≥ 16 11 Ờ 15 ≤ 10
3.4.6. Phương pháp xác ựịnh một số gen mã hóa tắnh kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella bằng phản ứng PCR của vi khuẩn Salmonella bằng phản ứng PCR
- Chuẩn bị DNA:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
máu ở 37oC trong 24 giờ. Lấy 1 Ờ 2 khuẩn lạc hòa vào 300 ộl nước khử ion vô trùng. đun cách thủy ở 100oC trong 15 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút phần dịch nổi có chứa DNA ựể làm phản ứng PCR.
- Tiến hành phản ứng PCR:
Thực hiện phản ứng PCR ựơn phức với mỗi phản ứng sử dụng một cặp mồi ựặc hiệu ựể xác ựịnh một loại gen kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ựược. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 cặp mồi khác nhau ựể xác ựịnh 2 loại gen kháng kháng sinh của các chủng
Salmonella, ựó là gen β-lactamase TEM (blaTEM) kháng ampicillin và gen
tetA(A) kháng tetracyclin. Trình tự nucleotide của 2 cặp mồi và kắch thước sản phẩm PCR tương ứng của chúng như ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi và kắch thước sản phẩm PCR tương ứng
Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide Sản phẩm
blaTEM-F 5'-GCACGAGTGGGTTACATCGA-3'
blaTEM-R 5'- GGTCCTCCGATCGTTGTCAG-3' 310 bp
tetA(A)-F 5'-GCTACATCCTGCTTGCCTTC-3'
tetA(A)-R 5'- CATAGATCGCCGTGAAGAGG-3' 210 bp Thành phần của phản ứng PCR bao gồm: 1X PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 0.2 uM mỗi loại primer, 0.05 ul Taq DNA polymerase, 1 ul DNA template và nước cất vừa ựủ 25 ul.
điều kiện của phản ứng PCR gồm các bước: Tiền biến tắnh ở 95ỨC/5 phút, sau ựó là 30 chu kỳ gồm biến tắnh ở 950C/ 1 phút, bắt cặp mồi ở 54ỨC/ 1 phút (với blaTEM) hoặc 58ỨC/ 1 phút (với tetA(A)), tổng hợp ở 72ỨC/ 1 phút và cuối cùng là kéo dài ở 72ỨC/ 7 phút.
Sản phẩm PCR sau ựó ựược ựiện di trên thạch agarose gel 1%, nhuộm bằng ethidium bromide và dùng ựọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc 2000 (bio- rad).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
đọc KQ bằng cách quan sát dưới ựèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Palaroid camerạ Sản phẩm PCR của Salmonella theo dõi là 310 bp, 210 bp.
3.4.7 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập ựược xử lý theo phương pháp thống kê sinh vật học và phần mềm Excel.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập và xác ựịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp.
để phục vụ nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thu thập ngẫu nhiên các mẫu bệnh phẩm gồm thịt lợn và mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn (gồm dao, thớt, bàn bày bán thịt) tại một số chợ nằm trên ựịa bàn 4 quận, huyện là Long Biên, Gia Lâm, Tây Hồ, Hoàn Kiếm thuộc thành phố Hà Nộị Mẫu bệnh phẩm sau khi thu thập ựược chuyển về phòng thắ nghiệm thuộc Bộ môn Vi trùng Ờ Viện Thú y ựể tiến hành nuôi cấy phân lập, xác ựịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. và nghiên cứu một số ựặc tắnh của chúng. Kết quả thu ựược chóng tềi trình bày ẻ cịc phẵn dưới ựây:
4.1.1 Kết quả xác ựịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. từ mẫu thịt lợn và mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn lợn và mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi ựã tiến hành thu thập ựược 130 mẫu bệnh phẩm gồm 65 mẫu thịt lợn và 65 mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn. Sau khi tiến hành nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp. trên các loại môi trường thông thường và ựặc hiệu dành cho vi khuẩn này như ựã nêu ở phần nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu, chúng tôi ựã xác ựịnh ựược tỷ lệ nhiễm loại vi khuẩn này như trình bày ở bảng 4.1 và hình 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả xác ựịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. từ mẫu thịt lợn và mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn
Kết quả phân lập Salmonella spp. TT Loại mẫu Số mẫu
kiểm tra Số mẫu dương tắnh Tỷ lệ (%)
1 Mẫu thịt 65 15 23,1
2 Mẫu lau dụng
cụ bán thịt 65 22 33,8
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42 0 5 10 15 20 25 30 35
Mẫu thẫt Mẫu lau dẫng cẫ bán thẫt Trung bình 23.1
33.8
28.4
T l (%)
Loi mu
Hình 4.1. Biểu ựồ so sánh tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. giữa các mẫu thịt lợn và mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn
Kết quả thu ựược cho thấy: trong tổng số 130 mẫu bệnh phẩm thu thập ựược ựã phân lập ựược 37 chủng vi khuẩn Salmonella spp., chiếm tỷ lệ 28,4%, trong ựó tỷ lệ phân lập ựược vi khuẩn này ở các mẫu lau dụng cụ bày bán thịt lợn là 22/65 mẫu (chiếm tỷ lệ 33,8%) cao hơn ở các mẫu thịt lợn với 15/65 mẫu (tỷ lệ 23,1%).
Như vậy, kết quả nghiên cứu cho thấy có tới 23,1% mẫu thịt lợn bị nhiễm vi khuẩn Salmonella. đây là ựiều ựáng lo ngại cho sức khoẻ cộng ựồng vì theo TCVN 5153-90 quy ựịnh, trong thịt và sản phẩm của thịt không ựược phép có mặt vi khuẩn Salmonella. điều này ựã giải thắch ựược tại sao vẫn có những vụ ngộ ựộc thực phẩm liên tục xảy ra trong cả nước trong thời gian quạ
Kết quả này của chúng tôi thấp hơn một chút so với một số nghiên cứu mới ựược công bố gần ựây như: đỗ Ngọc Thúy và cs (2006) khi nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn khác nhau trong thịt tươi tại các chợ tự do trên ựịa bàn Hà Nội ựã xác ựịnh ựược tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. ở thịt lợn là 27,3%; Trong một ựiều tra về phân lập và nhận biết các chủng Salmonella
spp. từ các mẫu thu thập ựược ở các giai ựoạn khác nhau trong toàn bộ chuỗi chế biến thịt lợn ở thành phố Huế, tác giả Takeshi và cs (2009) ựã xác ựịnh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43
ựược tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. từ thịt lợn bán lẻ tại các chợ là 32,8%; Trần Thị Nhài (2005) khi nghiên cứu về hiện trạng ô nhiễm vi khuẩn trong thịt tươi sống trên thị trường Hà Nội cho biết tỷ lệ nhiễm Salmonella spp.
trong các mẫu thịt lợn là 39,5%; Phạm Thị Thanh Huyền (2010) ựã phân lập và xác ựịnh một số ựặc tắnh sinh vật học của vi khuẩn Salmonella spp. từ thịt tươi tại một số chợ và siêu thị trên ựịa bàn nội thành Hà Nội cho biết tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. trong các mẫu thịt tươi là 27 %.
Kết quả thu ựược của chúng tôi thấp hơn nhiều của Van và cs (2007) trong một nghiên cứu với các mẫu thu thập ựược từ các chợ và siêu thị quanh khu vực thành phố Hồ Chắ Minh từ tháng 4 ựến tháng 6 năm 2004 ựã xác ựịnh ựược tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. trong thịt lợn là 64%. Theo chúng tôi, tỷ lệ