Việc ựiều trị bệnh do Salmonella gây ra ở người và gia súc bằng kháng sinh là rất cần thiết nhưng vấn ựề ựáng quan tâm là tắnh kháng thuốc của vi khuẩn này ngày một gia tăng trong mấy thập kỷ quạ đó là ựiều ựáng lo ngại trên toàn cầụ Theo Kishima và cs (2008), việc sử dụng rộng rãi kháng sinh ựể phòng và ựiều trị bệnh ựã làm xuất hiện ngày càng nhiều các chủng vi khuẩn
Salmonella kháng thuốc. Vào những năm 1990, toàn bộ Salmonella kháng thuốc chỉ chiếm có 20 ựến 30% nhưng ựã lên tới 70% vào những năm 2000 (Su và cs, 2004).
Một nghiên cứu ựược tiến hành trong khoảng thời gian từ 1997 Ờ 2000 tại 5 tỉnh của Canada về tắnh kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella cho thấy: trong số các chủng Salmonella phân lập ựược, 27% kháng Ampicillin, 2,2% kháng Trimethoprim/Sulfamethoxazole, 1,5% kháng Nalidixic acid và 1,2% kháng Ciprofloxacin (Leah J Martin và cs, 2006). Sự gia tăng tắnh kháng kháng sinh của rất nhiều các chủng vi khuẩn Salmonella ựã trở thành vấn ựề liên quan ựến sức khỏe con người và ựược quan tâm trên toàn thế giớị
Một nghiên cứu khác về tỷ lệ kháng kháng sinh của các serovar Salmonella
phân lập ựược từ lò mổ gia cầm tại Tây Ban Nha cho thấy: Trong tổng số 133 chủng Salmonella ựược thử, 100% số chủng kháng với ắt nhất một loại kháng sinh, trong ựó tỷ lệ kháng Sulfadiazine là 92,2%, Neomycine là 53,4% và Tetracycline là 21,8%. đặc biệt 65,4% chủng kháng với nhiều loại kháng sinh, riêng chủng vi khuẩn gây ngộ ựộc thực phẩm S. enteritidis thể hiện tới 23 kiểu mẫu (Pattern) kháng kháng sinh khác nhaụ Tại Brazil, trong số 91 chủng S. enteritidis phân lập ựược từ thịt gà, thực phẩm, người và các mẫu liên quan ựến gia cầm (nền chuồng, phân), có 91,1% số chủng kháng với hơn một loại kháng sinh, 75,8% số chủng kháng Sulfonamides, 52,8% kháng Nitrofuran, 51,6% số chủng cùng kháng với nhiều loại kháng sinh. Tỷ lệ kháng kháng sinh cũng ựáng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
báo ựộng với kết quả kiểm tra của 135 chủng Salmonella enterica serovar infantis
phân lập từ gia cầm tại tỉnh Kagoshima Ờ Nhật Bản (Shahada và cs, 2006).
Không chỉ dừng lại ở mức ựộ ựiều tra hiện trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn với các kỹ thuật thông thường, ngày nay bằng các kỹ thuật hiện ựại như PCR, PFGEẦ các nhà khoa học trên thế giới ựã tiến hành các nghiên cứu về các gen gây nên hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn, cũng như cơ chế và ựường truyền tắnh kháng kháng sinh của vi khuẩn từ ựộng vật sang ngườị Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiện tượng kháng kháng sinh có thể truyền từ ựộng vật sang người thông qua hoặc là: i) Những vi khuẩn kháng kháng sinh này có thể ựược truyền từ ựộng vật tàng trữ sang người thông qua ô nhiễm nguồn thực phẩm, nước và môi trường, hoặc thông qua tiếp xúc trực tiếp với ựộng vật; ii) Hoặc là truyền thẳng các gen, các plasmid kháng kháng sinh của vi khuẩn (Lee và cs, 2008).
Thời gian gần ựây các nhà khoa học rất chú ý ựến S. typhimurium
DT104, một chủng kháng ựa các loại thuốc (5 loại kháng sinh bao gồm Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfonamide và Tetracycline (ACSSuT), là nguyên nhân gây nên các ổ dịch tại Châu Âu và Mỹ (Baggesen và cs, 2000). Chủng ựa kháng thuốc S. typhimurium DT104 này ựược phát hiện lần ựầu tiên ở người mắc salmonellosis tại Anh vào năm 1980. Sau ựó ựược quan sát thấy cả ở người cũng như vật nuôi trên khắp thế giới vào những năm 90 và hiện ựang là mối lo ngại hàng ựầu ựối với sức khỏe cộng ựồng (Kishima và cs, 2008). Cho tới nay, S. typhimurium DT104 vẫn là chủng kháng thuốc nổi trội không chỉ kháng 5 loại thuốc nêu trên mà còn làm giảm khả năng mẫn cảm của Gentamicin, Trimethoprim và Fluoquinolones (Baggesen và cs, 2000). Ngoài ra, những serovar khác cũng ựược xem như kháng ựa các loại kháng sinh như S. infantis, S. newport và S. muenchen (Nguyễn Thị Bắch Thủy, 2009).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn cũng ựã ựược các nhà nghiên cứu trong nước ựề cập ựến khá lâu, bởi chắnh tắnh kháng thuốc ựã gây ra rất nhiều trở ngại trong công tác trị bệnh cho gia súc, gia cầm. Nguyên nhân của hiện tượng này thì chúng ta ựều biết rõ, ựó là việc sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi, kết hợp nhiều loại kháng sinh cùng một lúc với mong muốn ựiều trị bệnh hiệu quả hơn, nhưng cũng chắnh ựiều này ựã gây nên hiện tượng ỔnhờnỖ thuốc. Thêm vào ựó là việc sử dụng kháng sinh một cách không kiểm soát ựể bổ sung trong thức ăn gia súc, gia cầm như những chất kắch thắch tăng trọng.
Theo Trần Tịnh Hiền.www.y khoa (1989) có 1% S. typhi ựược phân lập tại Việt Nam ựã ựa kháng thuốc (Ampicillin, Chloramphenicol, Trimethoprim, Tetracycline và Sulphonamide), ựến năm 1993 ựã có 85% S. typhi kháng các kháng sinh nàỵ Từ năm 1992, việc sử dụng Fluoroquinolon bắt ựầu rộng rãi và chẳng bao lâu ựã phát hiện ựược trường hợp kháng Quinolon ở ựồng bằng sông Cửu Long. Năm 1997, có ựến 20% các trường hợp kháng loại kháng sinh này ựược phát hiện.
Tác giả Phạm Tất Thắng và cộng sự cũng cho biạt: hầu hết các vi khuẩn gây bệnh ựường tiêu hóa trên lợn ựã ựề kháng với hầu hết các loại kháng sinh thông thường sử dụng trong chăn nuôi lợn ở khu vực đồng Nai, Bình Dương và Thành phố Hồ Chắ Minh, ựặc biệt 77,8% vi khuẩn Ẹ coli và 66,7% vi khuẩn
Salmonella kháng với Chlotetracyclinẹ
Một số nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của Salmonella ở Việt Nam cũng ựã ựược công bố. Các nhà nghiên cứu Việt Ờ Nhật ựã tiến hành nghiên cứu trên 230 mẫu Salmonella phân lập ựược từ ựộng vật, thực phẩm và người tại khu vực sông Mekong, Việt Nam vào năm 2008 cho thấy 21,3% số mẫu kháng từ 1 ựến 5 loại thuốc kiểm tra (Ogasawara và cs, 2008).
Một nghiên cứu khác ở 180 mẫu thực phẩm sống (gồm thịt bò, thịt gà, tôm cua và sò) thu thập từ các chợ tại thành phố Hồ Chắ Minh năm 2007 cho
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
thấy 60,8% các mẫu thịt và 18% các mẫu hải sản bị nhiễm Salmonella spp. Trong số Salmonella phân lập ựược thì có ựến 50,5% số chủng kháng ắt nhất một loại kháng sinh và 20,9% kháng từ 3 lại thuốc trở lên (Van và cs, 2007).
Nghiên cứu của Hoàng Hoài Phương và cs (2008) cho biết mức ựộ kháng kháng sinh của các chủng Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm khá cao với 77,5% Salmonella spp.kháng với ắt nhất 1 kháng sinh. Tỉ lệ kháng ựa kháng sinh (từ 2 kháng sinh trở lên) của Salmonella spp. là 60%. Salmonella spp. kháng cao với chloramphenicol, tetracyclin, sulfamethoxazole-trimethoprim và ampicillin với tỷ lê từ 37,5% ựến 67,5%.
Nói chung, các nghiên cứu tại Việt Nam về hiện trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung, Salmonella nói riêng trong lĩnh vực thú y chưa mở rộng và chuyên sâu mà hầu hết mới chỉ dừng lại ở những nghiên cứu trong phạm vi hẹp với khắa cạnh Ổkháng sinh ựồỖ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
PHẦN III đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 đối tượng, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1 đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn Salmonella phân lập ựược từ các mẫu thịt lợn và dụng cụ bán thịt lợn tại một số chợ ở nội thành Hà Nộị
3.1.2 địa ựiểm nghiên cứu
- địa ựiểm lấy mẫu: một số chợ trên ựịa bàn 4 quận, huyện: Gia Lâm, Long Biên, Tây Hồ, Hoàn Kiếm thuộc thành phố Hà Nộị
- địa ựiểm tiến hành thắ nghiệm: Bộ môn Vi trùng Ờ Viện Thú y Quốc giạ
3.1.3 Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện: Từ tháng 12 năm 2011 ựến tháng 06 năm 2012
3.2 Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Phân lập và xác ựịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella từ các mẫu thịt lợn và dụng cụ bán thịt lợn thu thập ựược.
3.2.2 Giám ựịnh một số ựặc tắnh nuôi cấy và ựặc tắnh sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ựược.
3.2.3 Xác ựịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ựược. 3.2.4 Kiểm tra khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella
phân lập ựược.
3.2.5 Xác ựịnh một số gen mã hóa tắnh kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ựược.
3.3 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
3.3.1 Mẫu thắ nghiệm: Các mẫu thịt lợn và mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn ựược lấy ngẫu nhiên tại một số chợ thuộc các quận, huyện: Gia Lâm, Long Biên, Tây Hồ, Hoàn Kiếm của thành phố Hà Nộị
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
3.3.2 Các loại môi trường, hóa chất
* Môi trường:
- Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là những loại môi trường (của hãng: Eiken, Oxoid, Biorad,...) ở dạng tổng hợp, khi dùng pha theo công thức có sẵn bao gồm:
- Môi trường BPW, RV, MacConkey, Môi trường thạch CHROMTM
Salmonella và thạch DHL dùng ựể nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella - Môi trường TSI, LIM và môi trường Malonate dùng ựể giám ựịnh vi khuẩn Salmonella
- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) dùng ựể ựịnh typ và giữ giống vi khuẩn
* Hóa chất:
- Các loại ựường: Glucoza, Mantol, Lactoza, Sorbitol, Dextroza, Sucroza, Galactoza, Manitol, Arabinoza
- Thuốc nhuộm Gram, dung dịch KovacỖs, dung dịch Andrader - Giấy tẩm kháng sinh (do hãng Oxoid của Anh sản xuất)
3.3.3 Các loại kháng huyết thanh chuẩn ựể ựịnh typ vi khuẩn Salmonella
Kháng huyết thanh chuẩn do hãng Denka Seiken Cọ, Ltd, Tokyo, Nhật Bản sản xuất dùng ựể ựịnh type kháng nguyên O và H của vi khuẩn Salmonella
3.3.4 Các hóa chất, mồi và chủng vi khuẩn dùng cho phản ứng PCR
- Gồm mồi, Taq-DNA polymerase, dNTPs, ựệm phản ứng, ựệm ựiện di TAE (Tris-Acetic-EDTA), nhuộm ựiện di (Gel loading buffer), nhuộm DNA (Ethidium Bromide).
- Chủng vi khuẩn dùng làm ựối chứng dương gồm: S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
3.3.5 Dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thắ nghiệm
đĩa petri, lam kắnh, ống nghiệm, bình tam giác, pipet, micropipet, ống hút, que cấy, ựèn cồn, nồi hấp khử trùng, lò vi sóng, kắnh hiển vi,ẦẦ
3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu
Mẫu thịt lợn và mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn ựược lấy ngẫu nhiên tại một số chợ trên ựịa bàn Hà nộị Mẫu ựược lấy vào buổi sáng. Mỗi mẫu ựược ựựng riêng rẽ vào 1 túi nilon sạch vô trùng, có ghi rõ ký hiệu mẫụ Trên mỗi bàn thịt lấy 01 mẫu thịt lợn (30gram) và 01 mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn.
Lấy mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn: dùng miếng gạc vô trùng lau bàn bán
thịt lợn, dao, thớt.
Các mẫu ựược bảo quản trong nhiệt ựộ lạnh (4-8oC) và chuyển về phòng thắ nghiệm ựể xử lý mẫu trong cùng ngàỵ
3.4.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella
Tiến hành nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella dựa trên cơ sở quy trình phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Salmonella của Khoa Thú y ứng dụng và Thú y cộng ựồng, Trường đại học Nông Nghiệp và Thú y Obihiro, Nhật Bản, với một số cải tiến ựể phù hợp với ựiều kiện phòng thắ nghiệm tại Việt Nam. Quy trình phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Salmonella từ các mẫu bệnh phẩm ựược tóm tắt theo sơ ựồ 3.1.
3.4.3 Phương pháp giám ựịnh vi khuẩn Salmonella phân lập ựược
Bao gồm các phương pháp sau:
- Kiểm tra hình thái học, tắnh chất bắt màu, nhuộm gram
- Kiểm tra khả năng di ựộng trên môi trường lỏng và môi trường thạch - Phản ứng sinh Indol
- Phản ứng Oxidaze - Phản ứng Catalaze
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
3.4.4 Phương pháp xác ựịnh serotyp của vi khuẩn Salmonella phân lập ựược
Xác ựịnh serotyp của các chủng Salmonella phân lập ựược bằng các phản ứng ngưng kết trên phiến kắnh và trong ống nghiệm bằng kháng huyết thanh chuẩn (hãng Denka Seiken Cọ, Ltd. Tokyo, Nhật Bản) ựối với kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông H. Trên cơ sở kết quả thu ựược, tiến hành ựịnh danh chủng vi khuẩn kiểm tra dựa vào bảng phân loại Kauffmann và White (Popoff, 2001).
Sơ ựồ 3.1. Quy trình phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Salmonella từ các mẫu thịt lợn và mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn
Mẫu thịt lợn + Mẫu lau dụng cụ bán thịt lợn BPW (370C/ 18- 24 h) LIM (370C/ 20- 24 h) (370Malonate C/ 18- 24 h) TSI (370C/ 18- 24 h) Xác ựịnh serotyp Giữ giống RV (420C/ 18- 24 h) DHL (370C/ 20- 24 h) CHROM TMSalmonella (370C/ 20- 24 h)
Phản ứng lên men ựường
Xác ựịnh khả năng mẫn cảm kháng sinh
Xác ựịnh gen mã hoá tắnh kháng kháng sinh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
3.4.4.1 Xác ựịnh nhóm kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh ựa giá nhóm O
Sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh (Slide agglutination) ựể xác ựịnh nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella. đây là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể ựược sử dụng rất phổ biến trong phòng thắ nghiệm ựể chẩn ựoán và giám ựịnh các loại vi khuẩn.
- Chuẩn bị:
+ Khuẩn lạc vi khuẩn ựược nuôi cấy vào thạch TSI hoặc thạch thường ựể tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
+ Kháng huyết thanh chuẩn ựa giá. - Tiến hành:
+ Chia 1 phiến kắnh sạch làm 2 phần: 1 phần làm ựối chứng, và 1 phần làm thắ nghiệm. Nhỏ vào mỗi bên phiến kắnh một giọt nước sinh lý.
+ Lấy một ắt khuẩn lạc Salmonella cần ựịnh typ ựã ựược cấy trên thạch TSI hoặc thạch thường, hòa với mỗi giọt nước muối sinh lý ựã nhỏ sẵn ở hai bên phiến kắnh thành huyễn dịch kháng nguyên.
+ Nhỏ tiếp vào bên thắ nghiệm 1 giọt kháng huyết thanh ựa giá nhóm O, còn bên ựối chứng âm, nhỏ thêm một giọt nước muối sinh lý. Trộn ựều, lắc nhẹ phiến kắnh trong khoảng 30 Ờ 60 giâỵ
+ đọc kết quả: Phản ứng dương tắnh khi có cụm ngưng kết kiểu hạt xuất hiện, huyễn dịch xung quanh trong. Bên ựối chứng âm huyễn dịch vẫn ựục ựềụ
3.4.4.2 Xác ựịnh kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh ựơn giá nhóm O
Chủng cho kết quả dương tắnh với kháng huyết thanh O ựa giá, tiếp tục ựược xác ựịnh với các kháng huyết thanh ựơn giá. Cách làm tương tự như phương pháp ựã ựược trình bày ở phần 3.4.4.1.
3.4.4.3. Xác ựịnh kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella
Sau khi ựã xác ựịnh kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella, tiếp tục
tiến hành xác ựịnh kháng nguyên H của chúng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
(i) Xác ựịnh kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 1)
- Chuẩn bị:
+ Chủng vi khuẩn Salmonella cần ựịnh typ ựược cấy trên môi trường thạch TSI hoặc thạch thường, ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
+ Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ, cấy vào môi trường nước BHI (5ml) ựể tủ ấm 37oC trong 2 giờ hoặc qua ựêm ở nhiệt ựộ phòng. Sau ựó, thêm vào canh trùng 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung formalin (nước sinh lý + 1% Formalin) nhằm mục ựắch là ựể cố ựịnh kháng nguyên H.
+ Kháng huyết thanh nhóm H gồm: Ha, Hb, Hc, Hd, He,h, HG, Hi, Hk, HL, Hr, Hy, He,n, H1
- Tiến hành:
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh từ Ha ựến H1 vào mỗi ống nghiệm.
+ Dùng Micropipet, hút 450 ộl canh trùng Salmonella ựã xử lý ở trên và cho vào ống nghiệm ựã có chứa kháng huyết thanh.
+ Lắc nhẹ ựể trộn ựều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống nghiệm, sau ựó ựặt vào bể ủ nhiệt ở nhiệt ựộ 50oC trong 1 giờ.
+ đọc kết quả: Phản ứng dương tắnh thì có ngưng kết kiểu ựám mây, các cụm ngưng kết tương ựối lỏng lẻọ Phản ứng âm tắnh thì dung dịch trong ống nghiệm ựục ựềụ
(ii) Xác ựịnh kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 2)
Sau khi có kết quả xác ựịnh kháng nguyên H pha 1 của các chủng
Salmonella, chúng tôi tiến hành xác ựịnh tiếp kháng nguyên H pha 2 của chúng.
+ Hút 3,5 ml môi trường nước thịt HI hoặc BHI có chứa 0,25% thạch vào trong 1 ống nghiệm có nút vặn, có chứa sẵn 1 ống thủy tinh nhỏ hở 2 ựầụ
