2.3.5.1. Mô tả thí nghiệm
a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 8-10 năm 2009. d) Địa điểm: VSHNĐ.
2.3.5.2. Phương pháp nghiên cứu
Môi trường tạp dưỡng gồm: Zar-+DTĐN với tỷ lệ DTĐN tìm ra ở mục 3.4.
Spirulina được nuôi trong hệ kín thiết kế như ở mục 2, nồng độ tế bào khởi
đầu tìm ra ở mục 3.1, chếđộ sục không khí liên tục. 2.3.5.3. Chỉ tiêu theo dõi
Tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein, độ nhiễm tạp (bụi, vi sinh vật) của sinh khối khi kết thúc quá trình nuôi được phân tích.
2.3.5.4. Sản phẩm cần đạt
Sinh khối Spirulina sạchđược nuôi trên môi trường Zar-+DTĐN trong hệ kín có sục không khí.
2.3.6. Thí nghiệm 6: nuôi Spirulina trong hệ kín trên môi Zar-, sục biogas
a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 7-9 năm 2009. d) Địa điểm: VSHNĐ.
2.3.6.2. Phương pháp nghiên cứu
Môi trường tạp dưỡng gồm: Zar-+DTĐN với tỷ lệ DTĐN tìm ra ở mục 3.2.
Spirulina được nuôi trong hệ kín thiết kế như ở mục 2, nồng độ tế bào khởi
đầu tìm ra ở mục 3.1, chếđộ sục khí từ lên men biogas liên tục liên tục. 2.3.6.3. Chỉ tiêu theo dõi
Tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein, độ nhiễm tạp (bụi, vi sinh vật) của sinh khối khi kết thúc quá trình nuôi được phân tích.
Hàm lượng khí CO2 trước và sau khi sục vào hệ kín nuôi Spirulina. 2.3.6.4. Sản phẩm cần đạt
Sinh khối Spirulina nuôi trên môi trường Zar-+DTĐN có sục biogas trong hệ
kín.
2.4. Định tính ba loại enzyme protease, amylase, lipase
2.4.1. Mô tả thí nghiệm
a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 10-12 năm 2008. d) Địa điểm: VSHNĐ.
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu
Spirulina được nuôi trên môi trường rắn gồm: môi trường Zar- thạch có bổ
sung casein, tinh bột và dầu olive ở nồng độ 1%. 2.4.3. Chỉ tiêu theo dõi
Khả năng tạo ra vòng phân giải. 2.4.4. Sản phẩm cần đạt
Đánh giá khả năng sử dụng các cơ chất bổ sung của Spirulina.
2.5. Một số phương pháp sử dụng trong đề tài
Nguyên tắc
Dựa vào sự bay hơi nước do nhiệt để tính độ chênh lệch khối lượng trước và sau khi sấy.
Cách tiến hành.
Sấy giấy lọc ở nhiệt độ 70oC qua đêm, để nguội và đem cân, ghi lại trọng lượng G1.
Lấy 10 ml dịch nuôi, lọc qua giấy lọc.
Rửa phần trên giấy lọc bằng HCl để loại khoáng lẫn trong sinh khối. Giấy lọc cùng với sinh khối trên giấy lọc được sấy ở 700C qua đêm. Làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân, ghi lại trọng lượng G2.
Kết quả
Trọng lượng khô (DW) được xác định theo công thức 2 1 1000 10 G G DW = − x (g/l) Trong đó: 10 là thể tích dịch nuôi (ml), 1000 là số chuyển đổi từ ml sang l, G2 là trọng luợng giấy lọc và sinh khối đã sấy (g), G1 là trọng luợng giấy lọc đã sấy (g).
2.5.2. Tính năng suất sinh khối (P) [26]
0 0 t X X P t t − = − (g/l/ngày)
Trong đó : X0 (g/l) là nồng độ sinh khối ở thời gian t0 (ngày thứ 1),
Xt (g/l) là nồng độ sinh khối tại thời gian t (nồng độ sinh khối cao nhất ) sau t0 (ngày).
2.5.3. Định lượng chlorophyll [14], [26]
Nguyên tắc: dựa vào bước sóng hấp phụ cao nhất của chlorophyll để thu lấy giá trị A khi đo mầu.
Cách tiến hành
Lấy V (ml) mẫu đem lọc, thu phần trên giấy lọc cho vào ống 20 ml có vạch chia thể tích và thêm 5-15 ml methanol.
Đồng hóa mẫu với tốc độ 5000-15000 vòng/phút, trong 5-10 phút. Sau khi
đồng hóa đểở nhiệt độ phòng trong 10-20 phút.
Tiếp theo, đem dịch chiết ly tâm ở tốc độ 10000 vòng/phút, trong 5-7 phút. Thu phần dịch nổi, mầu trong, đem đo ở hai bước sóng 665 nm với dung dịch methanol làm mẫu chứng. Ghi nhận hai giá trị tương ứng là A665.
Tính kết quả
Chlorophyll tổng (mg/l) = 13,9 x A665
Trong đó: A660 là độ hấp thu của chlorophyll ở bước sóng 665 nm, và 13,9 là hệ số hấp thu của chlorophyll ở bước sóng 665 nm.
2.5.4. Định lượng carotenoid [15], [26]
Nguyên tắc: dựa vào tính tan trong dung môi hữu cơ để tách chiết carotenoid ra khỏi nguyên liệu. Dựa vào giá trị A thu được khi đo mầu để tính hàm lượng carotenoid có trong nguyên liệu.
Cách làm
1. Cân a g mẫu khô (hoặc V ml mẫu dạng lỏng, lọc qua giấy lọc, lấy phần trên giấy lọc làm thí nghiệm) cho vào cốc 100 ml.
2. Thêm 10-20 ml KOH 60%, lắc kỹ, đồng hóa mẫu bằng máy để
trong bểổn nhiệt ở 500C trong 5-10 phút.
3. Ly tâm mẫu với tốc độ 10000 vòng/phút, trong 5 phút.
4. Chuyển phần dịch nổi vào phễu tách và thêm 15-25 ml diethyl ether và 20-30 ml NaCl 9%.
5. Trộn kỹ và để cho đến khi dịch nổi phân làm hai lớp: mầu xanh lá cây ở dưới, mầu vàng ở trên.
6. Cẩn thận, thu lấy phần mầu xanh lá cây.
7. Thêm NaCl 9% và lặp lại bước 6 cho tới khi dịch tách thành hai lớp mầu vàng và mầu trắng trong suốt.
8. Tách và thu lấy phần dịch mầu vàng, cho thêm một lượng nhỏ
Na2SO4 vào để hấp thu nước.
9. Thêm diethyl ether vào dịch mầu vàng tới 25 ml và trộn đều. 10. Đo mầu ở bước sóng 450 nm với dung dịch diethyl ether làm mẫu chứng.
Tính kết quả: Carotenoid (mg/g) = 450*25*1000 260* A a Trong đó: A450: độ hấp phụđo được ở bước sóng 450 nm, Trọng lượng mẫu thí nghiệm,
260 là hệ số hấp thu của carotenoid ở bước sóng 450 nm.
2.5.5. Định lượng carbohydrate [3]
Nguyên tắc: Sựđịnh lượng này căn bản dựa trên phản ứng mầu đặc trưng cho bởi đường với sự hiện diện của H2SO4.
Cách tiến hành
Bước 1. Ly trích đường
Nghiền nguyên liệu cần định lượng đường, sau đó cân chính xác 1 – 2 g nguyên liệu đã nghiền nhuyễn chứa khoảng 5 – 50 mg đường cho vào cốc thủy tinh 50 ml, cho thêm 10 ml cồn 90o vào. Đun cốc trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần (mỗi lần sôi lấy cốc ra cho nguội bớt rồi đặt trở lại). Khuấy đều bằng que thủy tinh, để
nguội, lọc qua giấy lọc.
Sau đó thêm 10 ml cồn 80o vào cốc chứa cặn, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên nồi cách thủy. Để nguội, lọc. Tiếp tục làm như vậy khoảng 2 lần. Sau đó đưa cặn lên giấy lọc và tráng cốc 2 – 3 lần bằng cồn 80o nóng (nước tráng cũng cho cả lên lọc). Dịch lọc cho bay hơi ở nhiệt độ phòng hoặc đun nhẹ trên nồi cách thủy để cồn bay hơi hết.
Pha loãng cặn thu được với nước cất thành 50 ml. Để lắng, dung dịch này
đem đi hiện mầu để xác định hàm lượng đường, có thể pha loãng dung dịch đường tùy theo nồng độđường có trong dung dịch nhiều hay ít.
Bước 2. Thực hiện phản ứng mầu
Hút 1 ml dung dịch đường cần định lượng cho vào ống nghiệm rồi thêm vào 1 ml dung dịch phenol 5%. Sau đó, cho chính xác 5 ml H2SO4 đậm đặc vào ống
nghiệm (không để giây acid vào thành ống). Để 10 phút rồi lắc, giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30oC để hiện mầu.
Bước 3. Xây dựng đường chuẩn.
Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi bổ sung như bảng 2.1
Bảng 2.1 Thí nghiệm xây dựng đường chuẩn saccharose
Bình Saccharose 0,1% (ml) Nước cất (ml) 1 1 99 2 2 98 3 3 97 4 4 96 5 5 95 6 6 94 7 7 93
Chuẩn bị 8 ống nghiệm, lần lượt cho vào các ống như bảng 2.2 Bảng 2.2 Thí nghiệm phản ứng mầu của đường saccharose
Ống saccharose Dung dịch Phenol 5% (ml) H2SO4 (ml) Nồng độ saccharose (µg) 1 1 ml bình số 1 1 5 10 2 1 ml bình số 2 1 5 20 3 1 ml bình số 3 1 5 30 4 1 ml bình số 4 1 5 40 5 1 ml bình số 5 1 5 50 6 1 ml bình số 6 1 5 60 7 1 ml bình số 7 1 5 70 8 1 ml nước cất 1 5 0 Mầu bền vững trong vài giờ. Xác định cường độ mầu bằng máy quang phổ so mầu ở bước sóng 490 nm.
Tính kết quả
Vẽđường cong chuẩn: trị số mật độ quang của những ống mẫu phải trừđi trị
Mặt khác, trị số mật độ quang của dung dịch đường cần định lượng cũng phải trừđi trị số mật độ quang của ống thử không, rồi dựa vào đường cong chuẩn để suy ra nồng độ x, từđó tính ra lượng đường trong mẫu.
2.5.6. Xác định carbon hữu cơ tổng số [30]
Nguyên tắc
Phần trăm carbon được xác định theo nguyên tắc carbon được oxi hóa bằng K2Cr2O7 (kali dichcromate). Theo lượng K2Cr2O7 đã tiêu thụ mà tính ra lượng carbon.
Cách tiến hành
Cân phân tích 0,01 g mẫu cho vào ống nghiệm. Dùng buret rót vào 10 ml K2Cr2O7 0,4 N. Đun cách thủy CaCl2 , nhiệt độ sôi của nó ở 140 oC trong 20 phút.
Lấy ra rửa ống, để lắng qua đêm, rót ra so màu trên máy quang phổ kếở bước sóng 590 nm.
Xây dựng đồ thị chuẩn
Cân chính xác 0,2377 g saccharose tinh khiết chuyển vào bình định mức 100 ml thêm nước cất đến vạch rồi đảo đều (1 ml dung dịch này tương đương 1 mg carbon). Tiến hành theo bảng 2.3.
Bảng 2.3 Thí nghiệm xây dựng đường chuẩn carbon hữu cơ tổng
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Sacharose (ml) 0 0,25 0,5 1 2 3 4 5 6 K2Cr2O7 (ml) 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Đun cách thủy ở 140 oC trong nồi chứa CaCl2 trong 20 phút. Để lắng qua
đêm, đo ở bước sóng 590 nm bằng máy quang phổ kế.
Trị số mật độ quang của những ống chứng sau khi trừ đi trị số của ống thử
không sẽ xác định được một đường cong mẫu.
Với dung dịch mẫu cần xác định nồng độ bằng cách trừ đi trị số ống thử
không rồi chiếu lên đường cong mẫu, suy ra nồng độ x trong ống, từ đó tính được nồng độ carbon trong mẫu.
Tính kết quả
x.10-3.n 100
m %
C =
Với: x là nồng độ C được chiếu lên đồ thị mẫu, n là hệ số pha loãng,
m là khối lượng mẫu phân tích, g.
2.5.7. Định lượng đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl [3]
Nguyên tắc
Chất đạm được vô cơ hoá bằng H2SO4 đậm đặc thành amonsulphat (NH4)2SO4.
Muối này đem cho tác dụng với kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng NH3:
(NH4)2SO4 + NaOH → 2NH3 + H2O + Na2SO4 Sau đó, lượng NH3được hơi nước lôi cuốn sang một bình tam giác có chứa một lượng thừa H3BO3 mà ởđó H3BO3 tự phân ly:
H3BO3→ HBO2 + H2O
Khi cất đạm, NH3 bay sang sẽ phản ứng với HBO2
BO2- Là một base mạnh, bởi vậy dung dịch của bình hứng chuyển từ mầu tím
đỏ sang mầu xanh lá mạ. Lượng BO2-được tạo thành tương đương với NH3 đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định BO2- bằng cách chuẩn độ ngược với HCl 0,25N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ mầu xanh lá mạ sang mầu tím
đỏ.
BO2- + H+→ HBO2
Cách tiến hành Bước 1. Vô cơ hoá mẫu
Tùy theo hàm lượng đạm có trong mẫu mà khối lượng mẫu vô cơ hóa nhiều hay ít, Cân a (g) mẫu đã nghiền kỹ cho vào ống phá mẫu, bổ sung 1 g chất xúc tác
H2SO4đđ
Chất đạm → (NH4)2SO4 Xúc tác
và 5 ml H2SO4 đậm đặc đặt lên bếp tiến hành phá mẫu trong tủ hút, đun đến khi dung dịch có mầu xanh rồi trong suốt, tiếp tục đun thêm 30 phút nữa. Để nguội ở
nhiệt độ phòng. Khi phá mẫu xong, để nguội và bổ sung 50 ml nước cất, trộn đều và
để nguội, lắp vào máy chưng cất.
Bước 2. Chưng cất mẫu
Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 30ml NaOH 32%. Khởi động quy trình chưng cất, dịch chưng cất chuyển sang bình tam giác có chứa sẵn 20ml dung dịch chỉ thị mầu.
Ngừng chưng cất khi dịch chưng cất ra không còn NH3 (thử bằng giấy quỳ). Chuẩn độ bằng HCl 0,25N. Ngừng chuẩn độ khi xuất hiện mầu phớt đỏ.
Tính kết quả
Thông qua lượng HCl 0,25N ta biết được acid boric kết hợp với NH3 và từ đó biết được lượng NH3 giải phóng ra từ mẫu. 1 ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035g nitơ. %Nitơ tổng = 0,25*0,0035 *100 HCl V a Trong đó: VHCl làthể tích HCl 0,25N dùng để chuẩn độ, ml, và a là trọng lượng mẫu đem xác định, g.
Sau khi có kết quả N tổng, chúng ta có thể tính được hàm lượng protein trực tiếp trong nguyên liệu dựa theo công thức sau:
% Protein thô = % Ntổng x 6,25
2.5.8. Định lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet [3]
Nguyên tắc
Dùng ether nóng để hòa tan tất cả chất béo tự do trong thực phẩm. Sau đó làm bay hết ete, cân chất béo còn lại và tính hàm lượng lipid trong 100 g mẫu.
Cách tiến hành
Sấy giấy lọc kích thước 8 x 9 cm đến trọng lượng không đổi.
Cân chính xác m (g) nguyên liệu đã sấy khô và nghiền nhỏ cho vào giấy lọc, gói lại theo hình trụ, cân trọng lượng mẫu và giấy trước khi chiết rút lipid.
Đặt giấy lọc có chứa mẫu vào trụ chiết và bắt đầu chiết với ether dầu hỏa. Sau khi chiết xong (khoảng 8h), lấy mẫu ra, để trong tủ hút cho dung môi bay hơi hết, sau đó sấy đến trọng lượng không đổi.
Tính kết quả
Hàm lượng lipid có trong 100 g nguyên liệu được tính theo công thức sau:
1 100 P P X m − = × Trong đó:
X là hàm lượng lipid có trong nguyên liệu ởđộ khô tuyệt đối, %, P là khối lượng gói nguyên liệu trước khi chiết lipid, g,
P1 là khối lượng gói nguyên liệu sau khi chiết lipid và sấy, g, và m là khối lượng mẫu đem phân tích, g.
2.5.9. Xác định nồng độ CO2
Nồng độ CO2 được xác định bằng máy TELAIRE 7001 (CO2/Temperature Monitor, made in USA), đo từ 0-10000 ppm hoặc lớn hơn, độ chính xác ± 50 ppm.
Nguyên tắc hoạt động: máy TELAIRE 7001 dựa trên sự khác biệt nồng độ
CO2 bên trong và bên ngoài để tính lượng CO2 có trong mẫu phân tích.
2.5.10. Xác định hàm lượng khí O2 theo phương pháp thể tích [28]
Dụng cụ bình chứa chất hấp thu O2.
Chất hấp thu O2: 100 ml dung dịch pyrogallol 30% trong 500 ml dung dịch KOH 50%.
Cách tiến hành
Đưa V1 ml khí O2 vào bình chứa chất hấp thu O2, lắc cho đến khi thể tích không đổi, ghi lại thể tích V2. % O2 = 1 2 1 V 100 V V − × Trong đó: V1 là thể tích ban đầu của hỗn hợp khí, ml,
và V2 là thể tích còn lại sau khi khí O2 bị hấp thu, ml.
2.5.11. Xác định cường độ ánh sáng và độ truyền suốt của vật liệu làm hệ thống
Cường độ ánh sáng xác định bằng máy LI-250A Light Meter với cảm biến lượng tử LI-190SA.
Cường độ ánh sáng quang hợp là số lượng các lượng tử ánh sáng tới nằm trong dải sóng 400-700 nm trong một đơn vị thời gian và trên một đơn vị diện tích.
1 µmol s-1m-2 = 1 µE s-1m-2 = 6.022 X 1017 photons s-1m-2
Độ truyền suốt %độ truyền suốt = 2 1 AS 100 AS ×
Trong đó: AS1 là cường độ ánh sáng trên bề mặt ống, AS2 là cường độ ánh sáng dưới bề mặt ống, và 100 là số chuyển sang %.
2.5.12. Phương pháp xác định tổng nấm men, nấm mốc [6]
Nguyên tắc: nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật dị dưỡng, cần nguồn carbon hữu cơ từ môi trường bên ngoài. Dựa vào đặc điểm này để sử dụng kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường Plate Count Agar (PCA).
Môi trường và hóa chất
Môi trường tổng hợp PCA (casein, dịch chiết nấm men, dextrose, agar). Quy trình phân tích như sơđồ 2.2
Sơđồ 2.1 Quy trình định lượng tổng nấm men, nấm mốc
2.5.13. Kiểm tra E. coli
Phương pháp ISO 16649-2 : 2001