1.4.4.1. Nguyên liệu
Đặc điểm của nguyên liệu là giàu cellulose, ít lignin, tỷ lệ C/N 20 - 30. Trước khi sử dụng phải xử lý nguyên liệu với nước theo tỷ lệ thích hợp sao cho hàm lượng chất khô trong đó đạt khoảng 9 – 10%.
1.4.5.2. Nhiệt độ
Nhiệt độ tốt nhất cho lên men biogas là 35oC. Nếu nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn nhiệt độ tối ưu này thì mức độ sinh khí sẽ giảm dần.
1.4.5.3. pH
Độ pH thích hợp cho lên men biogas nằm trong giới hạn từ 6,5 – 7,5. Nếu lượng acid trong quá trình lên men tạo ra vượt quá khả năng sử dụng của vi khuẩn sinh khí metan thì pH sẽ giảm ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng và phát triển của loại vi khuẩn này.
1.5. Tổng quan về okara và dịch tương đậu nành [32], [33]
1.5.1. Giới thiệu về okara và dịch tương đậu nành
Okara và dịch tương đậu nành là phụ phẩm thu nhận từ một số quy trình công nghệ sản xuất các sản phẩm từđậu nành.
Okara được sử dụng rộng rãi và đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp chăn nuôi gia súc, gia cầm và vật nuôi. Trong okara có khoảng 18-32% protein, 9-18% xơ thô, chất béo khoảng 5-22%. Với thành phần như vậy, okara thích hợp là một nguồn nguyên liệu để lên men biogas.
Trong dịch tương đậu nành (DTĐN) vẫn chứa rất nhiều chất dinh dưỡng hòa tan như các đường đơn hoặc đường đa. Nhưng hiện nay, lượng dịch tương này hầu hết chưa được tận dụng và chỉđược coi như một loại chất thải.
Bảng 1.8 Thành phần dinh dưỡng của DTĐN sau quá trình chế biến đậu hũ [32]
Thành phần Đơn vị (%) Protein 0,60 Chất béo 0,05 Carbohydrate 2,5-3,0 Tro 0,60
Với thành phần dinh dưỡng như bảng 1.8 thì DTĐN hoàn toàn có thể sử dụng
để làm một loại môi trường nuôi vi sinh vật. Trong đề tài này, DTĐN được nghiên cứu tận dụng để nuôi Spirulina..
Hình 1.8 Bã okara Hình 1.9 Dịch tương đậu nành
1.5.2. Quy trình thu nhận okara và dịch tương đậu nành
CHƯƠNG 2 NỘI DUNG
2.1. Chế tạo bể lên men biogas
2.1.1. Mô tả thí nghiệm
a) Đối tượng: vi sinh vật lên men kỵ khí và các bể lên men kỵ khí. b) Quy mô: thể tích bể 25-40 lít, số lượng từ 6 đến 10 bể.
c) Thời gian: tháng 2-7/2008.
d) Địa điểm: Viện Sinh Học Nhiệt Đới(VSHNĐ). 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
- Các bể lên men được chế tạo chỉ có một đường khí ra. - Thể tích dịch lên men là 5-10 lít.
- Nguyên liệu lên men là bã đậu nành okara.
- Vi sinh vật lên men kỵ khí lấy từ bùn đáy sông Thị Nghè. 2.1.3. Các chỉ tiêu theo dõi
- Tỉ lệ (giống : tổng thể tích dịch lên men biogas). - Hàm lượng carbon tổng, nitơ tổng của nguyên liệu. - Lượng khí được tạo ra và thời gian lên men một mẻ. - Hàm lượng khí CO2 trong hỗn hợp khí lên men. - Hàm lượng khí O2 trong hỗn hợp lên men. 2.1.4. Sản phẩm cần đạt
Tạo được các bể lên men, thu được lượng khí đủđể sục vào hệ thống.
2.2. Xây dựng mô hình hệ thống kín nuôi Spirulina
2.2.1. Mô tả thí nghiệm
a) Đối tượng thí nghiệm: hệ kín nuôi Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm.
c) Thời gian: từ tháng 4/2008 đến tháng 4/2009. d) Địa điểm: VSHNĐ.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
Hệ kín là các ống hình trụ làm từ thủy tinh hoặc PE trong suốt. Đường kính trong 3,1 cm, chiều dài ống 120 cm, độ truyền suốt 95%, các ống được nối với nhau nhờ bộ nối PVC (polyvinylclorua) có khả năng lắp vào và tháo ra dễ dàng. Ngoài ra còn có lưới lọc sinh khối.
Khả năng hoạt động của hệ thống được kiểm tra về: + Thể tích hoạt động.
+ Cách sục khí vào.
+ Khả năng sử dụng lưới lọc sinh khối. 2.2.4. Sản phẩm cần đạt
Hệ thống vận hành đạt yêu cầu về độ kín, khả năng vận chuyển môi trường,
đảm bảo lưu thông và phối hợp hoạt động của các bộ phận.
2.3. Nuôi Spirulina
2.3.1. Thí nghiệm 1: xác định nồng độ tế bào ban đầu để nuôi Spirulina trên môi trường Zarrouk
2.3.1.1. Mô tả thí nghiệm
a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 5-7 năm 2008. d) Địa điểm: VSHNĐ.
2.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu
Bố trí thí nghiệm như sau: nuôi Spirulina với 4 nồng độ tế bào 0,1; 0,2; 0,3 và 0,4 g/l trong 200 ml môi trường Zarrouk chứa trong chai PET thể tích 330 ml, có lắp, chất liệu polyethylen (PE), nuôi tĩnh, điều kiện phòng thí nghiệm.
2.3.1.3. Chỉ tiêu theo dõi
Sự thay đổi nồng độ tế bào được theo dõi bằng trọng lượng khô theo ngày nuôi. Từ 4 giá trị trên, so sánh kết quả và kết luận giá trị tối ưu.
2.3.1.4. Sản phẩm cần đạt
Chọn được nồng độ sinh khối khởi đầu để nuôi Spirulina.
2.3.2. Thí nghiệm 2: nuôi Spirulina trong hệ hở trên môi trường Zarrouk
2.3.2.1. Mô tả thí nghiệm
a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm.
c) Thời gian: tháng 7 đến tháng 9 năm 2008. d) Địa điểm: VSHNĐ.
2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu
Hệ hở là các chậu chứa 10-20 lít dịch nuôi, được thực hiện ở cùng một vị trí với hệ kín (để có cùng cường độ ánh sáng), sử dụng môi trường Zarrouk để nuôi.
Chếđộđảo trộn: liên tục trong suốt quá trình nuôi bằng máy sục khí. 2.3.2.3. Chỉ tiêu theo dõi
Tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein trong sinh khối thu được khi kết thúc quá trình nuôi được ghi nhận để từđó so sánh với hệ kín.
2.3.2.4. Sản phẩm cần đạt
Thu sinh khối Spirulina từ hệ hở, xác định thời gian tăng trưởng.
2.3.3. Thí nghiệm 3: nuôi Spirulina trong hệ kín trên môi trường Zarrouk sục không khí liên tục ở ba vận tốc khác nhau không khí liên tục ở ba vận tốc khác nhau
2.3.3.1. Mô tả thí nghiệm
a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 2- 6 năm 2009. d) Địa điểm: VSHNĐ.
2.3.3.2. Phương pháp nghiên cứu
Spirulina được nuôi trong hệ kín thiết kế như ở mục 2, nồng độ tế bào khởi
đầu tìm ra ở mục 3.1, có 3 chếđộ sục khí liên tục được khảo sát. 2.3.3.3. Chỉ tiêu theo dõi
Tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein, độ nhiễm tạp (bụi, vi sinh vật) của sinh khối khi kết thúc quá trình nuôi được phân tích.
2.3.3.4. Sản phẩm cần đạt
Chọn được vận tốc dòng khí tối ưu. Thu sinh khối Spirulina sạchtừ hệ kín.
2.3.4. Thí nghiệm 4: xác định tỷ lệ dịch tương đậu nành thích hợp để nuôi
Spirulina
2.3.4.1. Mô tả thí nghiệm
a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 7-9 năm 2008. d) Địa điểm: VSHNĐ.
2.3.4.2. Phương pháp nghiên cứu
Spirulina được nuôi trong môi trường Zarrouk không chứa NaHCO3 với các tỷ lệ DTĐN: 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50%, so với tổng thể tích 200 ml dịch nuôi chứa trong chai PET thể tích 330 ml, có lắp, chất liệu polyethylen (PE), nuôi tĩnh, điều kiện phòng thí nghiệm. Mẫu đối chứng là nồng độ sinh khối tối ưu chọn được ở
mục 3.1.
2.3.4.3. Chỉ tiêu theo dõi
Sự thay đổi nồng độ sinh khối được theo dõi bằng trọng lượng khô theo ngày nuôi vào khoảng 4-5 giờ chiều. Từ kết quả thu được sẽ kết luận giá trị tối ưu.
2.3.4.4. Sản phẩm cần đạt
Chọn được tỷ lệ DTĐN thích hợp để nuôi Spirulina.
2.3.5. Thí nghiệm 5: nuôi Spirulina trong hệ kín trên môi trường Zar- (môi trường Zarrouk không có NaHCO3) và DTĐN (Zar-+DTĐN), sục không khí trường Zarrouk không có NaHCO3) và DTĐN (Zar-+DTĐN), sục không khí
2.3.5.1. Mô tả thí nghiệm
a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 8-10 năm 2009. d) Địa điểm: VSHNĐ.
2.3.5.2. Phương pháp nghiên cứu
Môi trường tạp dưỡng gồm: Zar-+DTĐN với tỷ lệ DTĐN tìm ra ở mục 3.4.
Spirulina được nuôi trong hệ kín thiết kế như ở mục 2, nồng độ tế bào khởi
đầu tìm ra ở mục 3.1, chếđộ sục không khí liên tục. 2.3.5.3. Chỉ tiêu theo dõi
Tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein, độ nhiễm tạp (bụi, vi sinh vật) của sinh khối khi kết thúc quá trình nuôi được phân tích.
2.3.5.4. Sản phẩm cần đạt
Sinh khối Spirulina sạchđược nuôi trên môi trường Zar-+DTĐN trong hệ kín có sục không khí.
2.3.6. Thí nghiệm 6: nuôi Spirulina trong hệ kín trên môi Zar-, sục biogas
a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 7-9 năm 2009. d) Địa điểm: VSHNĐ.
2.3.6.2. Phương pháp nghiên cứu
Môi trường tạp dưỡng gồm: Zar-+DTĐN với tỷ lệ DTĐN tìm ra ở mục 3.2.
Spirulina được nuôi trong hệ kín thiết kế như ở mục 2, nồng độ tế bào khởi
đầu tìm ra ở mục 3.1, chếđộ sục khí từ lên men biogas liên tục liên tục. 2.3.6.3. Chỉ tiêu theo dõi
Tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein, độ nhiễm tạp (bụi, vi sinh vật) của sinh khối khi kết thúc quá trình nuôi được phân tích.
Hàm lượng khí CO2 trước và sau khi sục vào hệ kín nuôi Spirulina. 2.3.6.4. Sản phẩm cần đạt
Sinh khối Spirulina nuôi trên môi trường Zar-+DTĐN có sục biogas trong hệ
kín.
2.4. Định tính ba loại enzyme protease, amylase, lipase
2.4.1. Mô tả thí nghiệm
a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 10-12 năm 2008. d) Địa điểm: VSHNĐ.
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu
Spirulina được nuôi trên môi trường rắn gồm: môi trường Zar- thạch có bổ
sung casein, tinh bột và dầu olive ở nồng độ 1%. 2.4.3. Chỉ tiêu theo dõi
Khả năng tạo ra vòng phân giải. 2.4.4. Sản phẩm cần đạt
Đánh giá khả năng sử dụng các cơ chất bổ sung của Spirulina.
2.5. Một số phương pháp sử dụng trong đề tài
Nguyên tắc
Dựa vào sự bay hơi nước do nhiệt để tính độ chênh lệch khối lượng trước và sau khi sấy.
Cách tiến hành.
Sấy giấy lọc ở nhiệt độ 70oC qua đêm, để nguội và đem cân, ghi lại trọng lượng G1.
Lấy 10 ml dịch nuôi, lọc qua giấy lọc.
Rửa phần trên giấy lọc bằng HCl để loại khoáng lẫn trong sinh khối. Giấy lọc cùng với sinh khối trên giấy lọc được sấy ở 700C qua đêm. Làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân, ghi lại trọng lượng G2.
Kết quả
Trọng lượng khô (DW) được xác định theo công thức 2 1 1000 10 G G DW = − x (g/l) Trong đó: 10 là thể tích dịch nuôi (ml), 1000 là số chuyển đổi từ ml sang l, G2 là trọng luợng giấy lọc và sinh khối đã sấy (g), G1 là trọng luợng giấy lọc đã sấy (g).
2.5.2. Tính năng suất sinh khối (P) [26]
0 0 t X X P t t − = − (g/l/ngày)
Trong đó : X0 (g/l) là nồng độ sinh khối ở thời gian t0 (ngày thứ 1),
Xt (g/l) là nồng độ sinh khối tại thời gian t (nồng độ sinh khối cao nhất ) sau t0 (ngày).
2.5.3. Định lượng chlorophyll [14], [26]
Nguyên tắc: dựa vào bước sóng hấp phụ cao nhất của chlorophyll để thu lấy giá trị A khi đo mầu.
Cách tiến hành
Lấy V (ml) mẫu đem lọc, thu phần trên giấy lọc cho vào ống 20 ml có vạch chia thể tích và thêm 5-15 ml methanol.
Đồng hóa mẫu với tốc độ 5000-15000 vòng/phút, trong 5-10 phút. Sau khi
đồng hóa đểở nhiệt độ phòng trong 10-20 phút.
Tiếp theo, đem dịch chiết ly tâm ở tốc độ 10000 vòng/phút, trong 5-7 phút. Thu phần dịch nổi, mầu trong, đem đo ở hai bước sóng 665 nm với dung dịch methanol làm mẫu chứng. Ghi nhận hai giá trị tương ứng là A665.
Tính kết quả
Chlorophyll tổng (mg/l) = 13,9 x A665
Trong đó: A660 là độ hấp thu của chlorophyll ở bước sóng 665 nm, và 13,9 là hệ số hấp thu của chlorophyll ở bước sóng 665 nm.
2.5.4. Định lượng carotenoid [15], [26]
Nguyên tắc: dựa vào tính tan trong dung môi hữu cơ để tách chiết carotenoid ra khỏi nguyên liệu. Dựa vào giá trị A thu được khi đo mầu để tính hàm lượng carotenoid có trong nguyên liệu.
Cách làm
1. Cân a g mẫu khô (hoặc V ml mẫu dạng lỏng, lọc qua giấy lọc, lấy phần trên giấy lọc làm thí nghiệm) cho vào cốc 100 ml.
2. Thêm 10-20 ml KOH 60%, lắc kỹ, đồng hóa mẫu bằng máy để
trong bểổn nhiệt ở 500C trong 5-10 phút.
3. Ly tâm mẫu với tốc độ 10000 vòng/phút, trong 5 phút.
4. Chuyển phần dịch nổi vào phễu tách và thêm 15-25 ml diethyl ether và 20-30 ml NaCl 9%.
5. Trộn kỹ và để cho đến khi dịch nổi phân làm hai lớp: mầu xanh lá cây ở dưới, mầu vàng ở trên.
6. Cẩn thận, thu lấy phần mầu xanh lá cây.
7. Thêm NaCl 9% và lặp lại bước 6 cho tới khi dịch tách thành hai lớp mầu vàng và mầu trắng trong suốt.
8. Tách và thu lấy phần dịch mầu vàng, cho thêm một lượng nhỏ
Na2SO4 vào để hấp thu nước.
9. Thêm diethyl ether vào dịch mầu vàng tới 25 ml và trộn đều. 10. Đo mầu ở bước sóng 450 nm với dung dịch diethyl ether làm mẫu chứng.
Tính kết quả: Carotenoid (mg/g) = 450*25*1000 260* A a Trong đó: A450: độ hấp phụđo được ở bước sóng 450 nm, Trọng lượng mẫu thí nghiệm,
260 là hệ số hấp thu của carotenoid ở bước sóng 450 nm.
2.5.5. Định lượng carbohydrate [3]
Nguyên tắc: Sựđịnh lượng này căn bản dựa trên phản ứng mầu đặc trưng cho bởi đường với sự hiện diện của H2SO4.
Cách tiến hành
Bước 1. Ly trích đường
Nghiền nguyên liệu cần định lượng đường, sau đó cân chính xác 1 – 2 g nguyên liệu đã nghiền nhuyễn chứa khoảng 5 – 50 mg đường cho vào cốc thủy tinh 50 ml, cho thêm 10 ml cồn 90o vào. Đun cốc trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần (mỗi lần sôi lấy cốc ra cho nguội bớt rồi đặt trở lại). Khuấy đều bằng que thủy tinh, để
nguội, lọc qua giấy lọc.
Sau đó thêm 10 ml cồn 80o vào cốc chứa cặn, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên nồi cách thủy. Để nguội, lọc. Tiếp tục làm như vậy khoảng 2 lần. Sau đó đưa cặn lên giấy lọc và tráng cốc 2 – 3 lần bằng cồn 80o nóng (nước tráng cũng cho cả lên lọc). Dịch lọc cho bay hơi ở nhiệt độ phòng hoặc đun nhẹ trên nồi cách thủy để cồn bay hơi hết.
Pha loãng cặn thu được với nước cất thành 50 ml. Để lắng, dung dịch này
đem đi hiện mầu để xác định hàm lượng đường, có thể pha loãng dung dịch đường tùy theo nồng độđường có trong dung dịch nhiều hay ít.
Bước 2. Thực hiện phản ứng mầu
Hút 1 ml dung dịch đường cần định lượng cho vào ống nghiệm rồi thêm vào 1 ml dung dịch phenol 5%. Sau đó, cho chính xác 5 ml H2SO4 đậm đặc vào ống
nghiệm (không để giây acid vào thành ống). Để 10 phút rồi lắc, giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30oC để hiện mầu.
Bước 3. Xây dựng đường chuẩn.
Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi bổ sung như bảng 2.1
Bảng 2.1 Thí nghiệm xây dựng đường chuẩn saccharose
Bình Saccharose 0,1% (ml) Nước cất (ml) 1 1 99 2 2 98 3 3 97 4 4 96 5 5 95 6 6 94 7 7 93
Chuẩn bị 8 ống nghiệm, lần lượt cho vào các ống như bảng 2.2 Bảng 2.2 Thí nghiệm phản ứng mầu của đường saccharose
Ống saccharose Dung dịch Phenol 5% (ml) H2SO4 (ml) Nồng độ saccharose (µg) 1 1 ml bình số 1 1 5 10 2 1 ml bình số 2 1 5 20 3 1 ml bình số 3 1 5 30 4 1 ml bình số 4 1 5 40 5 1 ml bình số 5 1 5 50 6 1 ml bình số 6 1 5 60 7 1 ml bình số 7 1 5 70 8 1 ml nước cất 1 5 0 Mầu bền vững trong vài giờ. Xác định cường độ mầu bằng máy quang phổ so mầu ở bước sóng 490 nm.
Tính kết quả
Vẽđường cong chuẩn: trị số mật độ quang của những ống mẫu phải trừđi trị
Mặt khác, trị số mật độ quang của dung dịch đường cần định lượng cũng phải trừđi