Mô tả thí nghiệm

a) Đối tượng: vi sinh vật lên men kỵ khí và các bể lên men kỵ khí. b) Quy mô: thể tích bể 25-40 lít, số lượng từ 6 đến 10 bể.

c) Thời gian: tháng 2-7/2008.

d) Địa điểm: Viện Sinh Học Nhiệt Đới(VSHNĐ). 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu

- Các bể lên men được chế tạo chỉ có một đường khí ra. - Thể tích dịch lên men là 5-10 lít.

- Nguyên liệu lên men là bã đậu nành okara.

- Vi sinh vật lên men kỵ khí lấy từ bùn đáy sông Thị Nghè. 2.1.3. Các chỉ tiêu theo dõi

- Tỉ lệ (giống : tổng thể tích dịch lên men biogas). - Hàm lượng carbon tổng, nitơ tổng của nguyên liệu. - Lượng khí được tạo ra và thời gian lên men một mẻ. - Hàm lượng khí CO2 trong hỗn hợp khí lên men. - Hàm lượng khí O2 trong hỗn hợp lên men. 2.1.4. Sản phẩm cần đạt

Tạo được các bể lên men, thu được lượng khí đủđể sục vào hệ thống.

2.2. Xây dựng mô hình hệ thống kín nuôi Spirulina

2.2.1. Mô tả thí nghiệm

a) Đối tượng thí nghiệm: hệ kín nuôi Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm.

c) Thời gian: từ tháng 4/2008 đến tháng 4/2009. d) Địa điểm: VSHNĐ.

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu

Hệ kín là các ống hình trụ làm từ thủy tinh hoặc PE trong suốt. Đường kính trong 3,1 cm, chiều dài ống 120 cm, độ truyền suốt 95%, các ống được nối với nhau nhờ bộ nối PVC (polyvinylclorua) có khả năng lắp vào và tháo ra dễ dàng. Ngoài ra còn có lưới lọc sinh khối.

Khả năng hoạt động của hệ thống được kiểm tra về: + Thể tích hoạt động.

+ Cách sục khí vào.

+ Khả năng sử dụng lưới lọc sinh khối. 2.2.4. Sản phẩm cần đạt

Hệ thống vận hành đạt yêu cầu về độ kín, khả năng vận chuyển môi trường,

đảm bảo lưu thông và phối hợp hoạt động của các bộ phận.

2.3. Nuôi Spirulina

2.3.1. Thí nghiệm 1: xác định nồng độ tế bào ban đầu để nuôi Spirulina trên môi trường Zarrouk

2.3.1.1. Mô tả thí nghiệm

a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 5-7 năm 2008. d) Địa điểm: VSHNĐ.

2.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu

Bố trí thí nghiệm như sau: nuôi Spirulina với 4 nồng độ tế bào 0,1; 0,2; 0,3 và 0,4 g/l trong 200 ml môi trường Zarrouk chứa trong chai PET thể tích 330 ml, có lắp, chất liệu polyethylen (PE), nuôi tĩnh, điều kiện phòng thí nghiệm.

2.3.1.3. Chỉ tiêu theo dõi

Sự thay đổi nồng độ tế bào được theo dõi bằng trọng lượng khô theo ngày nuôi. Từ 4 giá trị trên, so sánh kết quả và kết luận giá trị tối ưu.

2.3.1.4. Sản phẩm cần đạt

Chọn được nồng độ sinh khối khởi đầu để nuôi Spirulina.

2.3.2. Thí nghiệm 2: nuôi Spirulina trong hệ hở trên môi trường Zarrouk

2.3.2.1. Mô tả thí nghiệm

a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm.

c) Thời gian: tháng 7 đến tháng 9 năm 2008. d) Địa điểm: VSHNĐ.

2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu

Hệ hở là các chậu chứa 10-20 lít dịch nuôi, được thực hiện ở cùng một vị trí với hệ kín (để có cùng cường độ ánh sáng), sử dụng môi trường Zarrouk để nuôi.

Chếđộđảo trộn: liên tục trong suốt quá trình nuôi bằng máy sục khí. 2.3.2.3. Chỉ tiêu theo dõi

Tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein trong sinh khối thu được khi kết thúc quá trình nuôi được ghi nhận để từđó so sánh với hệ kín.

2.3.2.4. Sản phẩm cần đạt

Thu sinh khối Spirulina từ hệ hở, xác định thời gian tăng trưởng.

2.3.3. Thí nghiệm 3: nuôi Spirulina trong hệ kín trên môi trường Zarrouk sục không khí liên tục ở ba vận tốc khác nhau không khí liên tục ở ba vận tốc khác nhau

2.3.3.1. Mô tả thí nghiệm

a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 2- 6 năm 2009. d) Địa điểm: VSHNĐ.

2.3.3.2. Phương pháp nghiên cứu

Spirulina được nuôi trong hệ kín thiết kế như ở mục 2, nồng độ tế bào khởi

đầu tìm ra ở mục 3.1, có 3 chếđộ sục khí liên tục được khảo sát. 2.3.3.3. Chỉ tiêu theo dõi

Tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein, độ nhiễm tạp (bụi, vi sinh vật) của sinh khối khi kết thúc quá trình nuôi được phân tích.

2.3.3.4. Sản phẩm cần đạt

Chọn được vận tốc dòng khí tối ưu. Thu sinh khối Spirulina sạchtừ hệ kín.

2.3.4. Thí nghiệm 4: xác định tỷ lệ dịch tương đậu nành thích hợp để nuôi

Spirulina

2.3.4.1. Mô tả thí nghiệm

a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 7-9 năm 2008. d) Địa điểm: VSHNĐ.

2.3.4.2. Phương pháp nghiên cứu

Spirulina được nuôi trong môi trường Zarrouk không chứa NaHCO3 với các tỷ lệ DTĐN: 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50%, so với tổng thể tích 200 ml dịch nuôi chứa trong chai PET thể tích 330 ml, có lắp, chất liệu polyethylen (PE), nuôi tĩnh, điều kiện phòng thí nghiệm. Mẫu đối chứng là nồng độ sinh khối tối ưu chọn được ở

mục 3.1.

2.3.4.3. Chỉ tiêu theo dõi

Sự thay đổi nồng độ sinh khối được theo dõi bằng trọng lượng khô theo ngày nuôi vào khoảng 4-5 giờ chiều. Từ kết quả thu được sẽ kết luận giá trị tối ưu.

2.3.4.4. Sản phẩm cần đạt

Chọn được tỷ lệ DTĐN thích hợp để nuôi Spirulina.

2.3.5. Thí nghiệm 5: nuôi Spirulina trong hệ kín trên môi trường Zar- (môi trường Zarrouk không có NaHCO3) và DTĐN (Zar-+DTĐN), sục không khí trường Zarrouk không có NaHCO3) và DTĐN (Zar-+DTĐN), sục không khí

2.3.5.1. Mô tả thí nghiệm

a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 8-10 năm 2009. d) Địa điểm: VSHNĐ.

2.3.5.2. Phương pháp nghiên cứu

Môi trường tạp dưỡng gồm: Zar-+DTĐN với tỷ lệ DTĐN tìm ra ở mục 3.4.

Spirulina được nuôi trong hệ kín thiết kế như ở mục 2, nồng độ tế bào khởi

đầu tìm ra ở mục 3.1, chếđộ sục không khí liên tục. 2.3.5.3. Chỉ tiêu theo dõi

Tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein, độ nhiễm tạp (bụi, vi sinh vật) của sinh khối khi kết thúc quá trình nuôi được phân tích.

2.3.5.4. Sản phẩm cần đạt

Sinh khối Spirulina sạchđược nuôi trên môi trường Zar-+DTĐN trong hệ kín có sục không khí.

2.3.6. Thí nghiệm 6: nuôi Spirulina trong hệ kín trên môi Zar-, sục biogas

a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 7-9 năm 2009. d) Địa điểm: VSHNĐ.

2.3.6.2. Phương pháp nghiên cứu

Môi trường tạp dưỡng gồm: Zar-+DTĐN với tỷ lệ DTĐN tìm ra ở mục 3.2.

Spirulina được nuôi trong hệ kín thiết kế như ở mục 2, nồng độ tế bào khởi

đầu tìm ra ở mục 3.1, chếđộ sục khí từ lên men biogas liên tục liên tục. 2.3.6.3. Chỉ tiêu theo dõi

Tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein, độ nhiễm tạp (bụi, vi sinh vật) của sinh khối khi kết thúc quá trình nuôi được phân tích.

Hàm lượng khí CO2 trước và sau khi sục vào hệ kín nuôi Spirulina. 2.3.6.4. Sản phẩm cần đạt

Sinh khối Spirulina nuôi trên môi trường Zar-+DTĐN có sục biogas trong hệ

kín.

2.4. Định tính ba loại enzyme protease, amylase, lipase

2.4.1. Mô tả thí nghiệm

a) Đối tượng thí nghiệm: Spirulina. b) Quy mô: phòng thí nghiệm. c) Thời gian: tháng 10-12 năm 2008. d) Địa điểm: VSHNĐ.

2.4.2. Phương pháp nghiên cứu

Spirulina được nuôi trên môi trường rắn gồm: môi trường Zar- thạch có bổ

sung casein, tinh bột và dầu olive ở nồng độ 1%. 2.4.3. Chỉ tiêu theo dõi

Khả năng tạo ra vòng phân giải. 2.4.4. Sản phẩm cần đạt

Đánh giá khả năng sử dụng các cơ chất bổ sung của Spirulina.

2.5. Một số phương pháp sử dụng trong đề tài

™ Nguyên tắc

Dựa vào sự bay hơi nước do nhiệt để tính độ chênh lệch khối lượng trước và sau khi sấy.

™ Cách tiến hành.

Sấy giấy lọc ở nhiệt độ 70oC qua đêm, để nguội và đem cân, ghi lại trọng lượng G1.

Lấy 10 ml dịch nuôi, lọc qua giấy lọc.

Rửa phần trên giấy lọc bằng HCl để loại khoáng lẫn trong sinh khối. Giấy lọc cùng với sinh khối trên giấy lọc được sấy ở 700C qua đêm. Làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân, ghi lại trọng lượng G2.

™ Kết quả

Trọng lượng khô (DW) được xác định theo công thức 2 1 1000 10 G G DW = − x (g/l) Trong đó: 10 là thể tích dịch nuôi (ml), 1000 là số chuyển đổi từ ml sang l, G2 là trọng luợng giấy lọc và sinh khối đã sấy (g), G1 là trọng luợng giấy lọc đã sấy (g).

2.5.2. Tính năng suất sinh khối (P) [26]

0 0 t X X P t t − = − (g/l/ngày)

Trong đó : X0 (g/l) là nồng độ sinh khối ở thời gian t0 (ngày thứ 1),

Xt (g/l) là nồng độ sinh khối tại thời gian t (nồng độ sinh khối cao nhất ) sau t0 (ngày).

2.5.3. Định lượng chlorophyll [14], [26]

™ Nguyên tắc: dựa vào bước sóng hấp phụ cao nhất của chlorophyll để thu lấy giá trị A khi đo mầu.

™ Cách tiến hành

Lấy V (ml) mẫu đem lọc, thu phần trên giấy lọc cho vào ống 20 ml có vạch chia thể tích và thêm 5-15 ml methanol.

Đồng hóa mẫu với tốc độ 5000-15000 vòng/phút, trong 5-10 phút. Sau khi

đồng hóa đểở nhiệt độ phòng trong 10-20 phút.

Tiếp theo, đem dịch chiết ly tâm ở tốc độ 10000 vòng/phút, trong 5-7 phút. Thu phần dịch nổi, mầu trong, đem đo ở hai bước sóng 665 nm với dung dịch methanol làm mẫu chứng. Ghi nhận hai giá trị tương ứng là A665.

™ Tính kết quả

Chlorophyll tổng (mg/l) = 13,9 x A665

Trong đó: A660 là độ hấp thu của chlorophyll ở bước sóng 665 nm, và 13,9 là hệ số hấp thu của chlorophyll ở bước sóng 665 nm.

2.5.4. Định lượng carotenoid [15], [26]

™ Nguyên tắc: dựa vào tính tan trong dung môi hữu cơ để tách chiết carotenoid ra khỏi nguyên liệu. Dựa vào giá trị A thu được khi đo mầu để tính hàm lượng carotenoid có trong nguyên liệu.

™ Cách làm

1. Cân a g mẫu khô (hoặc V ml mẫu dạng lỏng, lọc qua giấy lọc, lấy phần trên giấy lọc làm thí nghiệm) cho vào cốc 100 ml.

2. Thêm 10-20 ml KOH 60%, lắc kỹ, đồng hóa mẫu bằng máy để

trong bểổn nhiệt ở 500C trong 5-10 phút.

3. Ly tâm mẫu với tốc độ 10000 vòng/phút, trong 5 phút.

4. Chuyển phần dịch nổi vào phễu tách và thêm 15-25 ml diethyl ether và 20-30 ml NaCl 9%.

5. Trộn kỹ và để cho đến khi dịch nổi phân làm hai lớp: mầu xanh lá cây ở dưới, mầu vàng ở trên.

6. Cẩn thận, thu lấy phần mầu xanh lá cây.

7. Thêm NaCl 9% và lặp lại bước 6 cho tới khi dịch tách thành hai lớp mầu vàng và mầu trắng trong suốt.

8. Tách và thu lấy phần dịch mầu vàng, cho thêm một lượng nhỏ

Na2SO4 vào để hấp thu nước.

9. Thêm diethyl ether vào dịch mầu vàng tới 25 ml và trộn đều. 10. Đo mầu ở bước sóng 450 nm với dung dịch diethyl ether làm mẫu chứng.

™ Tính kết quả: Carotenoid (mg/g) = 450*25*1000 260* A a Trong đó: A450: độ hấp phụđo được ở bước sóng 450 nm, Trọng lượng mẫu thí nghiệm,

260 là hệ số hấp thu của carotenoid ở bước sóng 450 nm.

2.5.5. Định lượng carbohydrate [3]

™ Nguyên tắc: Sựđịnh lượng này căn bản dựa trên phản ứng mầu đặc trưng cho bởi đường với sự hiện diện của H2SO4.

™ Cách tiến hành

™ Bước 1. Ly trích đường

Nghiền nguyên liệu cần định lượng đường, sau đó cân chính xác 1 – 2 g nguyên liệu đã nghiền nhuyễn chứa khoảng 5 – 50 mg đường cho vào cốc thủy tinh 50 ml, cho thêm 10 ml cồn 90o vào. Đun cốc trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần (mỗi lần sôi lấy cốc ra cho nguội bớt rồi đặt trở lại). Khuấy đều bằng que thủy tinh, để

nguội, lọc qua giấy lọc.

Sau đó thêm 10 ml cồn 80o vào cốc chứa cặn, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên nồi cách thủy. Để nguội, lọc. Tiếp tục làm như vậy khoảng 2 lần. Sau đó đưa cặn lên giấy lọc và tráng cốc 2 – 3 lần bằng cồn 80o nóng (nước tráng cũng cho cả lên lọc). Dịch lọc cho bay hơi ở nhiệt độ phòng hoặc đun nhẹ trên nồi cách thủy để cồn bay hơi hết.

Pha loãng cặn thu được với nước cất thành 50 ml. Để lắng, dung dịch này

đem đi hiện mầu để xác định hàm lượng đường, có thể pha loãng dung dịch đường tùy theo nồng độđường có trong dung dịch nhiều hay ít.

Bước 2. Thực hiện phản ứng mầu

Hút 1 ml dung dịch đường cần định lượng cho vào ống nghiệm rồi thêm vào 1 ml dung dịch phenol 5%. Sau đó, cho chính xác 5 ml H2SO4 đậm đặc vào ống

nghiệm (không để giây acid vào thành ống). Để 10 phút rồi lắc, giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30oC để hiện mầu.

Bước 3. Xây dựng đường chuẩn.

Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi bổ sung như bảng 2.1

Bảng 2.1 Thí nghiệm xây dựng đường chuẩn saccharose

Bình Saccharose 0,1% (ml) Nước cất (ml) 1 1 99 2 2 98 3 3 97 4 4 96 5 5 95 6 6 94 7 7 93

Chuẩn bị 8 ống nghiệm, lần lượt cho vào các ống như bảng 2.2 Bảng 2.2 Thí nghiệm phản ứng mầu của đường saccharose

Ống saccharose Dung dịch Phenol 5% (ml) H2SO4 (ml) Nồng độ saccharose (µg) 1 1 ml bình số 1 1 5 10 2 1 ml bình số 2 1 5 20 3 1 ml bình số 3 1 5 30 4 1 ml bình số 4 1 5 40 5 1 ml bình số 5 1 5 50 6 1 ml bình số 6 1 5 60 7 1 ml bình số 7 1 5 70 8 1 ml nước cất 1 5 0 Mầu bền vững trong vài giờ. Xác định cường độ mầu bằng máy quang phổ so mầu ở bước sóng 490 nm.

™ Tính kết quả

Vẽđường cong chuẩn: trị số mật độ quang của những ống mẫu phải trừđi trị

Mặt khác, trị số mật độ quang của dung dịch đường cần định lượng cũng phải trừđi trị số mật độ quang của ống thử không, rồi dựa vào đường cong chuẩn để suy ra nồng độ x, từđó tính ra lượng đường trong mẫu.

2.5.6. Xác định carbon hữu cơ tổng số [30]

™ Nguyên tắc

Phần trăm carbon được xác định theo nguyên tắc carbon được oxi hóa bằng K2Cr2O7 (kali dichcromate). Theo lượng K2Cr2O7 đã tiêu thụ mà tính ra lượng carbon.

™Cách tiến hành

Cân phân tích 0,01 g mẫu cho vào ống nghiệm. Dùng buret rót vào 10 ml K2Cr2O7 0,4 N. Đun cách thủy CaCl2 , nhiệt độ sôi của nó ở 140 oC trong 20 phút.

Lấy ra rửa ống, để lắng qua đêm, rót ra so màu trên máy quang phổ kếở bước sóng 590 nm.

™ Xây dựng đồ thị chuẩn

Cân chính xác 0,2377 g saccharose tinh khiết chuyển vào bình định mức 100 ml thêm nước cất đến vạch rồi đảo đều (1 ml dung dịch này tương đương 1 mg carbon). Tiến hành theo bảng 2.3.

Bảng 2.3 Thí nghiệm xây dựng đường chuẩn carbon hữu cơ tổng

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Sacharose (ml) 0 0,25 0,5 1 2 3 4 5 6 K2Cr2O7 (ml) 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Đun cách thủy ở 140 oC trong nồi chứa CaCl2 trong 20 phút. Để lắng qua

đêm, đo ở bước sóng 590 nm bằng máy quang phổ kế.

Trị số mật độ quang của những ống chứng sau khi trừ đi trị số của ống thử

không sẽ xác định được một đường cong mẫu.

Với dung dịch mẫu cần xác định nồng độ bằng cách trừ đi trị số ống thử

không rồi chiếu lên đường cong mẫu, suy ra nồng độ x trong ống, từ đó tính được nồng độ carbon trong mẫu.

™ Tính kết quả

x.10-3.n 100

m %

C =

Với: x là nồng độ C được chiếu lên đồ thị mẫu, n là hệ số pha loãng,

m là khối lượng mẫu phân tích, g.

2.5.7. Định lượng đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl [3]

™ Nguyên tắc

Chất đạm được vô cơ hoá bằng H2SO4 đậm đặc thành amonsulphat (NH4)2SO4.

Muối này đem cho tác dụng với kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng NH3:

(NH4)2SO4 + NaOH → 2NH3 + H2O + Na2SO4 Sau đó, lượng NH3được hơi nước lôi cuốn sang một bình tam giác có chứa