2.3.2.1. Thu thập mẫu
- Mẫu phân phân lập vi khuẩn: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng lợn mắc tiêu chảy và chưa dùng thuốc (kháng sinh) điều trị. Khi toàn bộ tăm bông thấm ướt phân lợn, lấy ra, cho ngay vào typ, vặn chặt, ghi ký hiệu mẫu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Mẫu phân để đếm số lượng vi khuẩn: lấy khoảng 2-3g phân từ hậu môn của các lợn mắc tiêu chảy vào 1 túi nilon sạch, ghi ký hiệu mẫu
- Mẫu bệnh phẩm gồm: lách, gan, chất chứa ruột non của lợn tiêu chảy - Tất cả các mẫu, sau khi lấy đều được bảo quản trong điều kiện lạnh 4oC theo quy trình bảo quản mẫu của Bộ môn Vi trùng, Viện thú Y và được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo.
2.3.2.2. Phân lập và giám định vi khuẩn đường ruột
Các phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú Y Quốc gia.
Thạch máu Thạch MacConkey Thạch máu yếm khí Thạch DHL Thạch BG Nước thịt PBW Thạch DHL Thạch BG 37oC/24- 48h/hiếu khí 37oC/24- 48h/hiếu khí Mọc trên thạch MacConkey
Trực khuẩn Gram âm
Dung huyết Trực khuẩn
37oC/24-48h/
yếm khí
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.1: Quy trình phân lập vi khuẩn đƣờng ruột (Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia)
2.3.2.2. Xác định số lượng vi khuẩn E. coli trong 1 g phân của lợn tiêu chảy hoặc bình thường
Mẫu là 1g phân của lợn bị tiêu chảy hoặc bình thường, được pha loãng trong dung dịch PBS thành các nồng độ 10-1
, 10-2, …, 10-8. Lấy 0,1 ml dung dịch ở các nồng độ đã pha loãng 10-6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
thạch MacConkey và thạch yếm khí. Bồi dưỡng ở 37oC trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí trong vòng 24 giờ. Mỗi nồng độ pha loãng dùng 3 đĩa thạch. Đếm số khuẩn lạc E. coli mọc trên đĩa thạch, rồi tính trung bình cho
mỗi nồng độ.
Số lượng vi khuẩn được tính theo công thức: X = 10 x a x b
Trong đó: X: là tổng số lượng vi khuẩn có trong 1 g phân hoặc chất chứa a: là số lượng vi khuẩn trung bình của nồng độ pha loãng thích hợp được chọn
b: là hệ số pha loãng mẫu Hệ số 10: vì cấy 0,1 ml
2.3.2.3. Xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính
Vi khuẩn E. coli có nhiều serotyp O khác nhau, do vậy, bước quan
trọng đầu tiên là xác định được nhóm serotyp O, sau đó tiến hành các phản ứng ngưng kết với các kháng huyết thanh đơn giá trong nhóm cần xác định. Những nguyên liệu cơ bản cho việc xác định serotyp gồm:
+ Các chủng E. coli cần định typ được giữ trên thạch máu + Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và đơn giá)
* Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính như sau:
Nhỏ lên 2 đầu lam kính sạch, mỗi đầu một giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E. coli cần xác định trên môi trường thạch máu trộn đều với 2 giọt nước muối sinh lý thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một bên huyễn dịch và một giọt nước muối sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (Đối chứng). Nếu có phản ứng ngưng kết sẽ xuất hiện sau 1 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Phản ứng dương tính khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì được đánh giá mức ++++. Tuỳ theo khả năng ngưng kết để có thể đánh giá mức ngưng kết ở các mức độ khác nhau +, ++, +++.
+ Phản ứng là âm tính khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh đục đều như bên đối chứng.
Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh nhóm, tiếp tục thực hiện như vậy với các kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm để xác định rõ từng serotyp. Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều đơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất.
2.3.2.4. Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được
2.3.2.4.1. Xác định các yếu tố gây bệnh (độc tố và yếu tố bám dính) của vi khuẩn bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp tạo dòng in vitro cho phép khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu từ một hệ gen phức tạp và tương đối dài mà không cần đến việc tách và nhân dòng (Cloning).
Nguyên lý: các phân tử acid nucleic trong môi trường pH trung tính thì
tích điện âm nhờ các nhóm phosphate nằm trên khung phosphodieste của các sợi nucleic. Khi đặt chúng vào trong điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tích trên thạch agarose, các phân tử acid tùy theo các kích thước sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau (loại có kích thước phân tử lớn sẽ chuyển dịch chậm, loại có kích thước phân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tử bé sẽ chuyển dịch nhanh hơn). Nguyên lý của phản ứng PCR dựa vào đặc điểm sao chép DNA, DNA-polymerase sử dụng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn mẫu để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung.
Mồi là đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu sợi DNA khuôn. Sau đó enzyme DNA-polymerase sẽ có chức năng kéo dài mồi để tạo sợi DNA mới.
* Cách tiến hành:
- DNA mẫu là khuẩn lạc vi khuẩn E. coli mọc trên môi trường thạch
máu ở 37o
C/24h.
- Hỗn hợp phản ứng PCR: gồm
Primers: 1 l mỗi loại
Dung dịch đệm (5X): 5.0 l Enzyme (Taq polymerase): 0.05 l
Nước khử ion vừa đủ để đạt được thể tích cuối cùng là 25 l cho 1 phản ứng.
- Chu trình của phản ứng PCR: Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và được thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer, theo sơ đồ sau:
Loại yếu tố gây bệnh cần
xác định
Chu trình
thứ nhất 30 chu trình tiếp theo
Chu trình cuối Biến tính (oC/phút) Biến tính (oC/phút) Gắn mồi (oC/phút) Tổng hợp (oC/phút) Tổng hợp (oC/phút) STa, STb, LT, F4 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 VT2e, F18 94/5 94/1 50/1 72/1 72/7
- Chạy điện di: Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) với mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 2% trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
dung dịch đệm TAE (Tris - acetate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút. Đây là cách để cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các phân tử acid nucleic trong môi trường pH trung tính thì tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tích trên thạch agarose, các phân tử acid nucleic tùy theo kích thước sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau: loại phân tử có kích thước lớn chạy chậm, loại có kích thước bé chuyển dịch nhanh hơn.
- Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy điện di được nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (BEt 1 l/ml) trong vòng 15 phút. BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trí cố định của các nhóm có khoảng cách gần với bazơ, tạo ra một lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử BEt tự do.
- Đọc kết quả: bằng cách quan sát dưới ánh đèn UV (300 m) và chụp ảnhbằng hệ thống GelDoc. Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại. Kích thước các băng DNA được so sánh với DNA chuẩn (DNA marker) được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác định được độ dài của đoạn sản phẩm PCR.
2.3.2.5. Kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập trên chuột bạch
Để xác định độc lực của các vi khuẩn gây bệnh, có thể thực hiện bằng phương pháp tiêm truyền qua động vật thí nghiệm. Các bước thực hiện như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Bước 1: Các vi khuẩn thuần từ môi trường giữ giống được cấy chuyển vào môi trường BHI trong bình tam giác 100ml. Canh trùng được bồi dưỡng ở 37o
C/24 giờ, trong quá trình nuôi có lắc đảo để kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn.
- Bước 2: Tiêm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu cho 2 chuột nhắt trắng khỏe mạnh (trọng lượng từ 18 - 20 g/con), với liều tiêm là 0,2 ml/chuột vào phúc xoang. Lô đối chứng gồm 2 chuột được tiêm dung dịch BHI với liều tiêm và đường tiêm tương tự.
- Bước 3: Kiểm tra và theo dõi thời gian chết, số lượng chuột chết trong vòng 7 ngày. Căn cứ vào số lượng chuột chết, giờ chuột chết bình quân của mỗi lô để đánh giá độc lực của vi khuẩn. Mổ khám, phân lập vi khuẩn từ máu tim của các chuột chết.
2.3.2.6. Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch và đánh giá kết quả theo Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm (NCCLS).
* Phương pháp tiến hành như sau:
- Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hinton.
- Bước 2: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 37oC. Lấy 1 khuẩn lạc, hoà vào 1,5 ml nước sinh lý để đạt được độ đục 0,5 trong dãy so màu McFarland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên thạch đĩa Muller Hinton.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.1: Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo NCCLS (1999) Kháng sinh Vòng vô khuẩn (đƣờng kính mm) Kháng Mẫn cảm trung bình Mẫn cảm Sulphamethoxazole/Trimethoprim (SXT 25) < 10 11 - 15 ≥16 Streptomycin (S 10) < 11 12 - 14 15 Gentamicin (CN 30) < 12 13 - 17 18 Neomycin (N 30) < 12 13 - 14 15 Cephalothin (KF 30) < 14 15 - 17 18 Amikacin (AK30) < 14 15 - 16 17 Apramycin (APR 15) < 10 11 - 14 15 Ceftiofur (EFT 30) < 17 18 - 20 21 Lincospectinomycin (LS 109) < 10 11 - 13 14 Enrofloxacin (ENR 5) < 16 17 - 19 20 Ampicillin (AML 10) < 11 12 - 14 15 Tetracycline (TE 30) < 14 15 - 18 19
- Bước 3: Dùng máy tự động đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) lên mặt đĩa thạch.
- Bước 4: Bồi dưỡng ở 37oC/18 - 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra.
2.3.2.7. Thử nghiệm một số phác đồ điều trị tiêu chảy cho lợn
Từ kết quả xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn một số phác đồ để điều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trị thử nghiệm cho các lợn bị tiêu chảy. Để đánh giá được hiệu quả một cách khách quan. Các phác đồ được thực hiện có sự đồng đều tương đối về các tiêu chí cơ bản sau:
- Số lợn tiêu chảy ở cùng một địa phương được phân ra làm 2 lô tương ứng với 2 phác đồ điều trị bệnh.
- Số lần và ngày điều trị bệnh được dùng đồng đều trong các phác đồ. - Đánh giá hiệu quả của các phác đồ điều trị căn cứ vào sự ổn định dần trạng thái phân, tình trạng ăn, uống ... sau 4 - 7 ngày, kể từ khi dùng thuốc.
2.3.2.8. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được được xử lý theo phương pháp toán học thông thường và thống kê sinh vật học của Nguyễn Văn Thiện.
Ứng dụng các phần mềm trong thống kê như: Excel, Minitab, Statgrhapic.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN