5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
3.2.1. Đặc điểm của gen GmEXP1 (cDNA) phân lập từ một số giống đậu
3.2.1.1.Tách dòng cDNA và xác định trình tự gen GmEXP1
Mục đích của việc phân lập gen là thu nhận đoạn DNA mã hóa cho protein
đích mang tính trạng quan tâm và có thể sử dụng được vào việc chuyển gen để cải tiến giống cây trồng. Một trong những phương pháp phân lập gen được sử dụng phổ
biến hiện nay là phân lập gen thông qua phiên mã ngược và nhân bản cDNA bằng kỹ thuật RT-PCR.
Thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân bản gen GmEXP1
Dựa trên trình tự gen GmEXP1 của đậu tương đã công bố tại Ngân hàng Gen quốc tế mang mã số AF516879, cặp mồi đặc hiệu SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI có trình tựnucleotide được thiết kế cho phản ứng PCR để nhân bản gen GmEXP1 từ
các mẫu nghiên cứu (Bảng 2.2).
Cặp mồi được thiết kế bao gồm cả trình tự chứa điểm cắt của enzyme giới hạn
để phục vụ cho việc phát triển vector sau này. Ở vị trí trước bộ ba mở đầu có bổ
sung 10 nucleotide trên mồi xuôi SoyEXP1F_NcoI chứa điểm cắt của enzyme NcoI và 12 nucleotide trên mồi ngược SoyEXP1R_NotI chứa điểm cắt của enzyme NotI
ngay sau bộ ba kết thúc. Năm 2003, Lee và cs đã phân lập gen GmEXP1 từ mRNA
thu được trình tự dài 1089 bp, trong đó trình tự mã hoá dài 768 bp. Như vậy, nếu khuếch đại gen GmEXP1 từ cDNA bằng cặp mồi trên thì kết quả sẽ cho sản phẩm PCR với kích thước là 10 + 768 + 12 = 790 bp.
Kết quả nhân bản gen GmEXP1
Các giống đậu tương nghiên cứu được ngâm ủ nứt nanh, gieo đạt 5 ngày tuổi thì tiến hành thu mẫu mô vùng sinh trưởng của rễ để phục vụ thí nghiệm tách chiết
RNA. RNA tổng số được tách chiết và tổng hợp cDNA, gen GmEXP1 được nhân bản bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI và sản phẩm
PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.2A).
Hình 3.2. Kết quảđiện di sản phẩm RT-PCR nhân gen GmEXP1 (A); colony-PCR chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp (B) và sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng BamHI (C)
1 - 6: các giống đậu tương Sơn La; 7: giống DT84; 1 - 28: các dòng vi khuẩn được chọn lọc bằng colony-PCR với cặp mồi pUC18; (+): đối chứng dương PCR từ cDNA_GmEXP1 với cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI; ĐC: plasmid tái tổ hợp không cắt bởi BamHI; M: thang DNA 1kb
Hình 3.2A cho thấy, phản ứng PCR từ cDNA với cặp mồi đã thiết kếthu được một băng DNA đặc hiệu duy nhất trên gel điện di có kích thước tương ứng với kích
thước gen GmEXP1 tính toán theo lý thuyết ước tính khoảng 0,79kb.
Tách dòng gen GmEXP1
Quá trình tách dòng gen được thực hiện nhờ biến nạp vector tái tổ hợp pBT_GmEXP1 vào vi khuẩn E.coliDH5α. Để lựa chọn các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa gen đích GmEXP1, tiến hành sàng lọc bằng kỹ thuật colony - PCR với cặp mồi pUC18F/pUC18R. Theo tính toán thì sản phẩm colony - PCR với cặp mồi pUC18F/pUC18R sẽthu được đoạn DNA có kích thước là 954 bp.
Chọn ngẫu nhiên mỗi mẫu biến nạp 4 khuẩn lạc trắng để thực hiện phản ứng colony - PCR. Kết quảđiện di sản phẩm colony - PCR thu được 24/28 dòng khuẩn lạc từ 7 mẫu biến nạp cho một băng DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 0,95 kb
tương ứng với kích thước lý thuyết đã ước tính (Hình 3.2B).
B A
Từ kết quả đó, mỗi giống đậu tương lựa chọn 3 khuẩn lạc dương tính đem nuôi trong môi trường LB lỏng chứa kháng sinh chọn lọc (carbenicillin) để thu nhận plasmid phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide của gen GmEXP1.
Trước khi giải trình tự gen, các plasmid tái tổ hợp được kiểm tra sự có mặt của
gen đích bằng BamHI. Theo tính toán, vector tái tổ hợp pBT_GmEXP1 có kích
thước là 2705 + 790 = 3495 (bp). Trên MCS của pBT có chứa hai điểm cắt của
BamHI cách hai phía của điểm tái tổ hợp 10 bp. Khi xử lý vector pBT tái tổ hợp bằng BamHI có thể thu được hai phân đoạn DNA chứa gen đích có kích thước là 810 bp chứa gen đích và phần còn lại của vector pBT là 2685 bp.
Kết quả cắt vector tái tổ hợp bằng BamHI ở 7/21 dòng khuẩn lạc kiểm tra đều
cho băng DNA đích khoảng 0,81 kb - tương ứng với kích thước ước tính theo lý thuyết (Hình 3.2C). Điều đó cho thấy, các mẫu plasmid thu được đều ở dạng tái tổ
hợp có thểmang gen đích GmEXP1, những mẫu này được sử dụng để xác định trình tự nucleotide của gen.
Xác định trình tự gen GmEXP1
Trình tự gen GmEXP1được xác định bằng máy giải trình tự gen tựđộng ABI Prism 3130 - USA/Japan. Gen GmEXP1 của 7 giống đậu tương nghiên cứu được
đọc lặp lại 3 lần/giống, xử lý và phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.
Kết quả phân tích hình 3.3 cho thấy, đoạn mã hoá của gen GmEXP1ở 6 giống
đậu tương SL và giống DT84 đều có kích thước là 768 bp, mã hoá 256 codon (255 amino acid và 1 codon kết thúc), tương ứng với kích thước của trình tự công bố trên Ngân hàng gen quốc tế mang mã số AF516879. Mức độtương đồng giữa hai trình tự gen phân lập được so với AF516879 đạt 99,3 - 99,7%. Như vậy có thể khẳng
định, cDNA GmEXP1 đã được phân lập thành công từ các giống đậu tương nghiên
cứu. Trình tự gen của 7 giống đậu tương đã được Ngân hàng gen quốc tế chấp nhận và đăng với các mã số: HG799004, HG799005, HG799006, HG799007, HG799008, HG799009, HG799010.
3.2.1.2.So sánh trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen GmEXP1
Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GmEXP1 phân lập từ các giống
đậu tương SL và giống DT84 với trình tự mang mã số AF516879 trên Ngân hàng gen quốc tế đã xác định được hệ số tương đồng giữa các trình tự là 99,3 - 99,7%.
Hình 3.3 cho thấy trình tự nucleotide của 7 giống đậu tương có tới 5 vị trí sai khác (93, 258, 360, 594 và 722) so với AF516879.
Hình 3.3. So sánh trình tự gen GmEXP1_cDNA của Ngân hàng gen quốc tế (AF516879) và của bảy giống đậu tương nghiên cứu
Phân tích protein suy diễn cho thấy, sai khác nucleotide ở các vị trí 93, 258,
360 và 594 không làm thay đổi amino acid; sai khác ở vị trí 722 dẫn đến sự sai khác amino acid thứ 241 của chuỗi polypeptid. Ở vị trí này, trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen mang mã số AF517689 là valine, còn của các giống nghiên cứu là alanin. Mức độ tương đồng về trình tự amino acid suy diễn của protein expansin1 ở
các giống đậu tương SL và DT84 so với trình tựAF516879 đạt 99,6%.
Amino acid thứ 241 nằm trong vùng II (domain II) của protein expansin - vùng giữ vai trò bám dính với các phân tử polysaccharide [32], [108]. Sự sai khác ở
vị trí này giữa các giống đậu tương rất có thể đưa đến sự khác nhau về khả năng
hoạt động bám dính và xúc tác kéo giãn vách cellulose của tế bào.
Vùng mã hoá của gen GmEXP1 ở 7 giống đậu tương Sơn La và DT84 có sai khác ở 3 vị trí nucleotide: 258, 360 và 594 (Hình 3.3). Vị trí 258 của giống SL1, SL4 và SL6 là cytosine, của SL2, SL3, SL5 và DT84 là thimine; vị trí 360 và 594: giống SL1 là guanine, các giống còn lại là adenine. Tuy nhiên, những vị trí sai khác
này đều rơi vào nucleotide thứ 3 của codon (vị trí linh hoạt Wobble) nên protein suy diễn của các giống đậu tương nghiên cứu hoàn toàn giống nhau, hay nói cách khác
là không có điểm sai khác về trình tự amino acid.
Để tìm hiểu đặc điểm về trình tự gen GmEXP1 của một số giống đậu tương ở địa phương khác ngoài 6 giống đậu tương địa phương Sơn La, chúng tôi tiếp tục
phân lập và giải trình tự gen expansin của hai giống đậu tương địa phương khác là giống đậu tương đậu tương Bắc Kạn (vùng núi phía Bắc) và đậu tương Vĩnh Phúc
(vùng trung du). Trình tự mã hoá của gen GmEXP1 phân lập từ hai giống đậu tương
kểtrên đều có kích thước 768 bp, mã hoá 255 amino acid. Khi so sánh hai trình tự
mã hoá của gen GmEXP1ở hai giống mới phân lập với 7 giống nghiên cứu cho thấy mức độ tương đồng của hai giống với các giống đậu tương Sơn La và DT84 dao động trong khoảng 99,4 - 100%. Trình tự amino acid của đậu tương Bắc Kạn có một điểm sai khác ở vị trí thứ 212 (Bắc Kạn là serine, các giống còn lại là alanine); trình tự amino acid của đậu tương Vĩnh Phúc không có điểm sai khác với 7 giống đã nghiên cứu (phụ lục 1). Như vậy có thể thấy, trình tự mã hoá của gen GmEXP1ở các giống đậu tương Việt Nam tương đối bảo thủ, bền vững trong tiến hoá mặc dù phân bốở những khu vực khác nhau.
3.2.1.3.Phân tích đặc điểm của gen GmEXP1 phân lập từ DNA tổng số
Để phân tích cấu trúc gen trên hệ gen và xác định vị trí trong hệ thống phân loại phân tử của gen GmEXP1, đồng thời làm căn cứđể phân tích sự có mặt của gen chuyển trong hệgen cây đậu tương chuyển gen, chúng tôi tiến hành phân lập và giải trình tự gen GmEXP1 từ DNA tổng số của một số giống đậu tương nghiên cứu. Kết quả phân lập gen bằng cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI từ DNA tổng sốở
lá của hai giống đậu tương (SL1, DT84), tách dòng trong E.coli và giải trình tựđều
cho đoạn DNA kích thước 1513 bp. Tiến hành BLAST hai trình tự phân lập được với Ngân hàng gen quốc tế xác định cả hai trình tự có mức độ tương đồng 83,4 - 83,5% với gen EXP1 (Gene ID: 548040) thuộc NST số 17 của đậu tương. Như vậy có thể khẳng định, gen GmEXP1đã được phân lập thành công từ DNA tổng số của hai giống SL1 và DT84. Hai trình tự gen của hai giống SL1 và DT84 đã được Ngân hàng gen quốc tế chấp nhận và đăng với các mã số: LM651915 và LM651916.
So sánh trình tự gen GmEXP1 phân lập từ DNA và cDNA
Việc so sánh trình tự gen GmEXP1 phân lập từ DNA và phân lập từ cDNA ở
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự DNA và cDNA của gen GmEXP1 phân lập từ giống SL1
Trong khung đỏ là trình tự nhận biết của enzyme giới hạn; Trong khung xanh là trình tự các intron; Phần không đóng khung là trình tự các exon
Hình 3.4 cho thấy, sản phẩm PCR khuếch đại gen GmEXP1 từ DNA bằng cặp mồi đặc hiệu có tổng chiều dài là 1513 bp, bao gồm trình tự nhận biết của enzyme giới hạn ở hai đầu dài 22 bp và gen GmEXP1_DNA dài 1491 bp. Gen gồm có 3 exon với tổng chiều dài là 768 bp xen kẽ bởi 2 intron có tổng chiều dài là 723 bp.
Đoạn mã hoá của gen GmEXP1 xác định protein dài 255 amino acid; protein suy diễn có điểm đẳng điện (pI) và trọng lượng phân tử được xác định bằng phần mềm ExPASy Compute pI/Mw [149] cho kết quả là pI = 9,12 và trọng lượng phân tử: 27,566 kDa. Đối chiếu với hệ thống phân loại của Zhu và cs đề xuất năm 2014
[147], gen GmEXP1 phân lập được từđậu tương chính là gen GmEXPA37 xác định protein thuộc phân họ α-expansin; nằm trên cặp NST số 17. Kết quả phân tích này cũng phù hợp với nghiên cứu của Libault và cs (2010) khi phân tích và xây dựng bản đồ di truyền mRNA ở cây đậu tương [79].
Qua việc phân lập thành công gen GmEXP1 từ DNA tổng số có thể thấy, cặp mồi đặc hiệu SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI có thể dùng để phân biệt cây đậu
tương mang gen chuyển với cây không mang gen chuyển GmEXP1 bằng phản ứng PCR. Đối với đậu tương mang gen chuyển, cặp mồi này có thể khuếch đại GmEXP1
nội tại cho kích thước đoạn DNA là 1513 bp, đồng thời khuếch đại cả GmEXP1
ngoại lai (không gồm intron) cho kích thước đoạn DNA là 790 bp. Cây không mang gen chuyển chỉ khuếch đại được một sản phẩm là GmEXP1 nội tại cho kích thước
đoạn DNA là 1513 bp.
So sánh hai trình tự gen DNA GmEXP1 của SL1 và DT84
Để thấy được sự đa hình gen DNA GmEXP1 của một số giống đậu tương
nghiên cứu, chúng tôi thực hiện so sánh hai trình tự gen phân lập được từ hai giống
đậu tương SL1 và DT84, kết quả so sánh hai trình tự thể hiện ở bảng 3.4. Sự sai khác ở một số vị trí nucleotide giữa SL1 và DT84 xảy ra trên cả intron và exon.
Trên intron 1 có ba điểm sai khác (vị trí 175, 242 và 245); intron 2 chứa một điểm sai khác (vị trí 806). Sự sai khác không xảy ra ở exon 1 giữa hai giống so sánh, chỉ
STT Vị trí SL1 DT84 Vùng chứa sai khác 1 175 T C Intron 1 2 242 A G Intron 1 3 245 T C Intron 1 4 482 C T Exon 2 5 584 G A Exon 2 6 806 G A Intron 2 7 1317 G A Exon 3
Sai khác ởintron không làm thay đổi vùng mã hoá, do vậy không làm thay đổi các amino acid trong chuỗi polypeptid. So sánh giữa hai giống nghiên cứu cho thấy,
đột biến điểm xảy ra trên intron (4) nhiều hơn so với exon (3), điều này đã minh chứng thêm vai trò giảm áp lực quá trình đột biến của intron đối với gen GmEXP1.