5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
3.4.2. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế
3.4.2.1.Xác định sự có mặt của gen GmEXP1 trong hệ gen cây thuốc lá T0
Hình 3.11. Kết quảđiện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen GmEXP1 trong các
cây thuốc lá chuyển gen
M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 44: các cây thuốc lá chuyển gen; wt:cây đối chứng không chuyển gen; (+): PCR từ vector chuyển gen pCB301_GmEXP1
Tiến hành thu mẫu 44 cây thuốc lá T , tách chiết và tinh sạch DNA, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI) để kiểm tra sự có mặt của gen GmEXP1. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen chuyển
GmEXP1 trên gel agarose 0,8% thể hiện trên hình 3.11.
Kết quả kiểm tra cho thấy 32/44 cây thuốc lá dương tính với phản ứng PCR.
Trên gel điện di xuất hiện duy nhất một băng đặc hiệu khoảng 0,79 kb, tương ứng với kích thước của gen GmEXP1 ở mẫu đối chứng dương (Hình 3.11). Hiệu suất chuyển gen tính đến giai đoạn này đạt 32/60 = 53,33%.
Các cây thuốc lá chuyển gen cho kết quảdương tính với phản ứng PCR được tiếp tục theo dõi phục vụ những phân tích, đánh giá khả năng hoạt động và biểu hiện của gen chuyển.
3.4.2.2.Xác định sự có mặt sản phẩm phiên mã của gen chuyển trên các cây thuốc lá chuyển gen T0 bằng kỹ thuật RT-PCR
Để xác định khả năng hoạt động của gen GmEXP1 trong 32 cây thuốc lá chuyển gen dương tính với PCR, chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR. Đây là kỹ
thuật cho phép phát hiện nhanh sự biểu hiện của gen chuyển thông qua hoạt động phiên mã của gen ngoại lai trong cây thuốc lá chuyển gen.
Các cây thuốc lá được tách chiết RNA tổng số, thực hiện tổng hợp cDNA bằng enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) và sau đó tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (SoyEXP1F_NcoI/SoyEXP1R_NotI). Sản phẩm RT-PCR
được kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.12)
Hình 3.12. Kết quảđiện di sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen GmEXP1 trong
các cây thuốc lá chuyển gen
M: thang chuẩn DNA 1kb; 24 - 36: sản phẩm RT-PCR các cây thuốc lá chuyển gen (+): sản phẩm PCR vector chuyển gen GmEXP1; wt: sản phẩm RT-PCR cây thuốc lá không chuyển gen.
Kết quảđiện di kiểm tra ở hình 3.12 cho thấy, các cây thuốc lá chuyển gen số
26, 30 và 36 xuất hiện một băng DNA với kích thước khoảng 0,79 kb, tương ứng với kích thước của gen GmEXP1. Như vậy, trong số 32 cây thuốc lá T0 chuyển gen
dương tính với phản ứng PCR, có 3 cây mang gen chuyển GmEXP1 hoạt động phiên mã tạo sản phẩm mRNA.
Các cây thuốc lá chuyển gen cho kết quả dương tính với phản ứng RT-PCR
được tiếp tục theo dõi phục vụ những phân tích, đánh giá khả năng hoạt động và biểu hiện của gen chuyển.
3.4.2.3.Đánh giá mức độ phiên mã gen chuyển trên các cây thuốc lá chuyển gen T0 bằng Real-time RT-PCR
Đểđánh giá mức độ phiên mã của gen chuyển GmEXP1 trên các cây thuốc lá chuyển gen bằng Real-time RT-PCR, chúng tôi sử dụng phương pháp 2-ΔΔCt của
Livak xác định tỷ lệ biểu hiện của gen đích [83]. Phương pháp này cần định lượng sản phẩm PCR của hai gen là gen tham chiếu (actin) và gen cần kiểm tra (GmEXP1) trong cùng một mẫu nghiên cứu bằng hai cặp mồi tương ứng. Cặp mồi sử dụng để định lượng gen GmEXP1được thiết kế dựa trên trình tựgen đã sử dụng để phát triển vector chuyển gen (trình tự gen GmEXP1 - cDNA từ giống SL1).
Chuẩn bị mẫu cho phản ứng Real-time RT-PCR
Mẫu cho phản ứng Real-time RT-PCR cần chuẩn bị là cDNA được tổng hợp với mồi ngẫu nhiên từ khuôn RNA tổng số bằng kít RevertAid First Strand cDNA Synthesis. Mẫu lá các cây thuốc lá chuyển gen GmEXP1được sử dụng để tách chiết RNA tổng số bằng kít Trizol Reagent và đưa vào phản ứng RT-PCR với một lượng ngang nhau (500 ng/phản ứng) sau khi xác định hàm lượng bằng máy NanoDrop.
Trước khi tiến hành phản ứng Real-time RT-PCR, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự bắt cặp của mồi và khuôn cDNA đã chuẩn bị bằng phản ứng PCR trong máy luân nhiệt với nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi thiết kế cho phản ứng Real-time (qEXP1- F/qEXP1-R và qAct-F/qAct-R). Kết quảđiện di kiểm tra sản phẩm PCR trên agarose 0,8% thể hiện ở hình 3.13.
Hình 3.13. Kết quảđiện di sản phẩm khuếch đại của các cặp mồi chuẩn bị cho phản ứng Real-time RT-PCR trên các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0
A26-36: Sản phẩm khuếch đại gen actin từ cDNA cây thuốc lá chuyển gen với cặp mồi qAct-F/qAct-R;
Awt: Sản phẩm khuếch đại gen actin từ cDNA cây thuốc lá không chuyển gen;
E26 - 36: Sản phẩm khuếch đại gen GmEXP1 từ cDNA các cây thuốc lá chuyển gen, và Ewt: Sản phẩm PCR trên cây thuốc lá không chuyển gen với cặp mồi qEXP1-F/qEXP1-R;M: thang chuẩn
DNA 50 bp
Trên gel điện di (Hình 3.13) xuất hiện hai băng ở vị trí khoảng 152 bp và 133
bp tương ứng với kích thước sản phẩm phát hiện gen actin và gen GmEXP1 của hai cặp mồi đã thiết kế. Ở các cây thuốc lá chuyển gen và không chuyển gen, gen actin
đều hoạt động ổn định, trên gel điện di xuất hiện một băng đặc hiệu ở vị trí khoảng 152 bp khi kiểm tra bằng RT-PCR với cặp mồi qAct-F/qAct-R. Kết quả điện di kiểm tra RT-PCR với cặp mồi qEXP1-F/qEXP1-R cho thấy, làn điện di của các cây thuốc lá chuyển gen số 26, 30 và 36 xuất hiện băng điện di ở vị trí khoảng 133 bp;
trong khi đó làn điện di của cây thuốc lá đối chứng không chuyển gen (Ewt) không xuất hiện băng DNA ở vị trí tương ứng. Bước kiểm tra trên đã chứng minh khả năng bắt cặp và khuếch đại sản phẩm từ các mẫu cDNA của hai cặp mồi đã thiết kế, có thể sử dụng tốt cho phản ứng Real-time RT-PCR.
Kết quả phân tích mức độ phiên mã bằng Real-time RT-PCR
Thực hiện phản ứng Real-time RT-PCR các mẫu phân tích thuộc các cây thuốc lá chuyển gen T0đã chuẩn bịởbước trên bằng kít LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I với các cặp mồi đã thiết kế. Kết quả của phản ứng Real-time RT-PCR được trình bày ở hình 3.14 và bảng 3.7.
A B
Hình 3.14. Đồ thịngưỡng nhiệt (A), và đồ thị phân tích nhiệt độ nóng chảy (B) của hai gen
GmEXP1 và actin ở các mẫu thuốc lá chuyển gen T0 trong phản ứng Real-time RT-PCR a: Nhóm các đường biểu diễn của gen actin; b:Nhóm các đường biểu diễn của gen GmEXP1
Hình 3.14A cho thấy, các đường biểu diễn sự khuếch đại cDNA của gen tham chiếu actin ở các mẫu phản ứng tương đối ổn định, giá trị ngưỡng nhiệt (Ct) tập trung ở khoảng chu kỳ thứ 24. Trong khi đó, giá trị ngưỡng nhiệt (Ct) của gen chuyển GmEXP1 ở các cây thuốc lá chuyển gen dao động trong khoảng chu kỳ thứ
20 - 22. Chu kỳ ngưỡng (Ct) của đối chứng âm các gen actin và GmEXP1 đều sau chu kỳ thứ 35 nên được coi là âm tính với Real-time. Ngoài ra, để khẳng định cây thuốc lá không chuyển gen (WT) không mang gen GmEXP1, chúng tôi thực hiện phản ứng Real-time RT-PCR mẫu thuốc lá WT với cặp mồi qEXP1-F/qEXP1-R.
Kết quả cho thấy, Ct gen GmEXP1 của mẫu cây thuốc lá không chuyển gen là 37,84 (sau chu kỳ thứ 35), nghĩa là mẫu kiểm tra không có gen GmEXP1.
Đồ thị phân tích nhiệt độ chảy và đỉnh chảy hình 3.14B cho thấy, nhiệt độ
chảy của sản phẩm khuếch đại gen actin nằm ở vị trí khoảng 84oC và của GmEXP1
ở vị trí khoảng 82oC. Qua đó cho phép khẳng định chỉ có hai loại sản phẩm DNA
được khuếch đại trong mỗi ống phản ứng Real-time; không có sản phẩm phụ không
đặc hiệu. Như vậy có thể coi hiệu suất phản ứng Real-time không bị ảnh hưởng, từ đó cho phép phân tích mức độ sai khác trong phiên mã của gen chuyển GmEXP1.
a b a b a b
thuốc lá chuyển gen thế hệ T0
Mẫu Ct_EXP1 Ct_Actin ΔCt(T) ΔCt(C) ΔΔCt R/26
Cây 36 21,75 23,90 -2,15 0,00 1,11
Cây 30 20,89 23,93 -3,04 -1,03 2,04
Cây 26 21,96 23,97 -2,01 -0,14 1,00
Từ các phân tích trên, các giá trị Ct nhận được qua phản ứng Real-time RT- PCR (Phụ lục 3) được tổng hợp đểxác định các giá trịΔCt, ΔΔCt và tỷ lệ biểu hiện
R theo phương pháp của Livak. Vì cây WT không mang gen GmEXP1, nên mẫu đối chứng để so sánh theo công thức của Livak được lựa chọn là cây chuyển gen có tỷ
lệ biểu hiện gen chuyển thấp nhất (cây 26). Kết quả phân tích ở bảng 3.7 cho thấy, tỷ lệ biểu hiện của gen đích GmEXP1ở các cây chuyển gen số 36 cao hơn cây 26 là
1,11 lần và cây số30 cao hơn cây 26 gấp 2,04 lần.
3.4.2.4.Phân tích biểu hiện protein expansin tái tổ hợp trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0
Biểu hiện gen được xem là quá trình hoạt động của gen để tạo ra sản phẩm cuối cùng là protein. Gen chuyển hoạt động phiên mã trong tế bào cây chuyển gen cho sản phẩm mRNA và xác định trình tự các amino acid trong chuỗi polypeptide thông qua quá trình dịch mã. Để đánh giá sự có mặt của protein ngoại lai do gen chuyển xác định cần phải thực hiện chiết rút protein, điện di biến tính trên SDS- PAGE và thực hiện phản ứng lai Western.
Sử dụng công cụ ExPASy đã xác định được trọng lượng phân tử protein expansin là 27,56 kDa. Ngoài ra, protein ngoại lai expansin còn có thêm chuỗi peptide c-myc cho sản phẩm protein cuối cùng có trọng lượng khoảng 30 kDa.
Kết quả phân tích protein bằng kỹ thuật Western blot
Đây là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong phân tích để phát hiện protein ngoại lai dựa trên nguyên lý của phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên (là sản phẩm protein cần tìm) và kháng thể đặc hiệu đối với kháng nguyên đó. Trong cấu trúc mang gen chuyển GmEXP1được thiết kế có trình tự nucleotide xác định chuỗi
peptide c-myc nằm ở phía đầu 3’ của gen GmEXP1. Nhờ đó sản phẩm polypeptide (nếu có) của cấu trúc gen chuyển có trình tự peptid c-myc ở phía đầu C là tín hiệu kháng nguyên cho phản ứng lai Western.
Protein các cây thuốc lá chuyển gen trên gel polyacrylamide sau khi đã thấm truyền lên màng lai nitrocellulose được xử lý qua các bước blocking, lai kháng thể
1, lai kháng thể 2 và hiện màu của cơ chất TMB với enzyme gắn trên màng. Kết quả
lai Western trên mẫu của các cây thuốc lá chuyển gen để kiểm tra sự có mặt của protein expansin trong cây chuyển gen được thể hiện trên hình 3.15.
Hình 3.15. Kết quả lai Western các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0
M: thang chuẩn protein; 26, 30, 36: protein các cây thuốc lá chuyển gen; (+): đối chứng dương là
protein 37 kDa có chuỗi c-myc phía đầu C; wt: protein cây thuốc lá đối chứng (không chuyển gen)
Hình 3.15 cho thấy, trên màng lai nitrocellulose xuất hiện băng màu ở vị trí
kích thước khoảng 30 kDa trên giếng điện di của các cây thuốc lá chuyển gen số 26,
30 và 36. Điều đó chứng tỏ, cả ba cây thuốc lá chuyển gen đều có protein ngoại lai
mang đuôi c-myc nên xảy ra phản ứng tạo màu của enzyme trên kháng thể với cơ
chất. Giếng điện di protein cây thuốc lá không chuyển gen do không có protein gắn
đuôi c-myc nên không xảy ra phản ứng tạo màu. Như vậy có thể thấy, gen GmEXP1
đã hoạt động biểu hiện tổng hợp protein expansin tương ứng trên cây thuốc lá N. tabacum K326.
Với việc sử dụng nguồn gen EXP1 từ giống đậu tương SL1 có bộ rễ phát triển tốt, chúng tôi đã phát triển thành công vector mang cấu trúc gen GmEXP1 phù hợp với việc biểu hiện ở thực vật. Cấu trúc gen chuyển GmEXP1 được biến nạp thành công vào cây thuốc lá. Phân tích cây thuốc lá mô hình cho thấy, gen GmEXP1 đã
được gắn vào hệ gen; gen chuyển đã hoạt động phiên mã cho sản phẩm mRNA tương ứng và đã dịch mã cho sản phẩm cuối cùng là protein. Đây là nguồn nguyên liệu cho việc phân tích khảnăng biểu hiện của gen chuyển và là cơ sởbước đầu đểđánh giá đặc điểm hình thái sự phát triển bộ rễ của thực vật chuyển gen.
Kết quả chuyển gen trên cây thuốc lá mô hình là bước đầu thử nghiệm và đánh giá để tiến hành chuyển cấu trúc đã thiết kếvào cây đậu tương.