5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
1.3.1.Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong chuyển ge nở cây đậu tương thông qua
A. tumefaciens
1.3.1.1.Nghiên cứu chuyển gen ởcây đậu tương thông qua A. tumefaciens
Hai nhóm phương pháp được ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. Trong đó, phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua A. tumefaciens
Chuyển gen gián tiếp là kỹ thuật biến nạp DNA (gen) nhờ nhân tố trung gian là vi sinh vật, thường dùng vi khuẩn Agrobacterium hoặc virus. Trong các kỹ thuật chuyển gen gián tiếp, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
được sử dụng rộng rãi hơn cả bởi vì phương pháp này dễ sử dụng, ít tốn kém và mang lại hiệu quả cao (số copy của gen biến nạp ít - tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào) [4].
Nhiều nghiên cứu cho thấy cây đậu tương dễ mắc bệnh khối u do vi khuẩn
A.tumefaciens gây ra. Tác nhân gây bệnh khối u là do Ti-plasmid (Tumor inducing) trong vi khuẩn A.tumefaciens [85]. Ti-plasmid được cấu tạo là một phân tử DNA kép, mạch vòng có kích thước khoảng 200 kb. Trên Ti-plasmid có hai phân đoạn DNA quan trọng liên quan trực tiếp đến sự hình thành và phát triển khối u thực vật là vùng T-DNA và vùng vir. Vùng T-DNA có kích thước khoảng 25 kb được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) là đoạn thâm nhập vào hệ
gen tế bào thực vật. T-DNA mang các gen tạo khối u như auxin, cytokinin, opine...
Vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp T-DNA vào bộ gen cây chủ và tiêu hoá opine [16]. Sản phẩm hoạt động của các gen nằm
trong vùng virdưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương
là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2, virC1... Các protein
này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây Hai lá mầm), tác động tạo ra các T-DNA sợi đơn, bao bọc che chở các đoạn T-DNA này và giúp
chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn. Dựa trên cơ chế chuyển gen tự nhiên này, T-DNA được cải biến thành phần di truyền, loại bỏ gen độc, bổ
sung gen chỉ thị chọn lọc và một số thành phần khác để trở thành vector chuyển gen mong muốn vào thực vật [17].
Trong số các loài gây bệnh ở thực vật, A. tumefaciens được coi là một vector sinh học sử dụng để chuyển gen mong muốn vào cây đậu tương [62]. Việc cải biến di truyền thành phần Ti-plasmid và lựa chọn giống đậu tương phù hợp đã góp phần
tăng hiệu suất chuyển gen đậu tương [113].
Hinchee (1988) là người đầu tiên công bố đầu tiên về tái sinh cây đậu tương
Sau đó, những tiến bộ trong kỹ thuật chuyển gen và tái sinh cây đậu tương chuyển gen liên tiếp đạt được thành công. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các mô đích khác nhau để chuyển gen như: phôi mầm đang phát triển [98], lá mầm và hợp tử đang
phát triển [140], qua thân mầm [20], qua mô sẹo callus [54]... Nhiều tác giảđã thực hiện phối hợp giữa chuyển gen Agrobacterium và súng bắn vi đạn để gây tổn
thương mô đích tạo điểm xâm nhập cho vi khuẩn [45], [122], [133].
Hiện nay, sự thành công và đưa vào sản xuất cây đậu tương chuyển gen chủ
yếu nhờ sự lây nhiễm bởi A. tumefaciens tái tổ hợp thông qua việc gây tổn thương nách lá mầm hạt chín [44], [97], [99], [140]. Nách lá mầm là phần nối giữa lá mầm
và thân mầm. Vị trí này chứa các tế bào mầm có khả năng phát sinh chồi và tăng sinh trong môi trường nuôi cấy có cytokinin. Việc bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy các chất khử như L-systeine và thiolsex làm tăng hiệu quả chuyển gen từ nách lá mầm đậu tương. Các thành phần bổ sung dường như làm ức chế các phản
ứng giữa vết thương và vi khuẩn, vì thế làm tăng khả năng biến nạp gen của vi khuẩn A. tumefaciens [96].
Hệ thống chọn lọc sử dụng trong chuyển gen đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và lựa chọn các tế bào, mô biến đổi gen. Hầu hết các vector chuyển
gen đều được thiết kế hệ thống chọn lọc kèm theo gen đích cho phép sàng lọc các tế
bào, mô, hay cây mang gen ở giai đoạn sớm bằng biểu hiện kháng của gen đánh dấu với các chất chọn lọc. Các gen chọn lọc có thể là các gen kháng chất kháng sinh, kháng chất diệt cỏ, gen chỉ thị màu hoặc gen chuyển hóa các cơ chất chọn lọc. Chất chọn lọc có thểlà kháng sinh như kanamycin (nếu gen chọn lọc sử dụng là gen nptII) hay hygromycin (khi dùng gen hpt) hoặc thuốc diệt cỏ basta (khi dùng gen bar).
Một số nghiên cứu công bố tạo cây đậu tương chuyển gen cho thấy, hiệu suất chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens thấp hơn so với phương
pháp chuyển gen bằng súng bắn gen qua phôi soma [97], [143]. Tuy nhiên, ưu thế
của chuyển gen gián tiếp là có thể chuyển được những phân đoạn DNA kích thước lớn, sốlượng bản sao (copy) ít, sự di truyền của gen đích ổn định và bền vững ở thế
hệ sau, hệ thống chuyển gen đơn giản dễ thực hiện... Vì thế, chuyển gen vào đậu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tương nhờ A. tumefaciens đang dần trở nên phổ biến và thu được những thành tựu
1.3.1.2.Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong phân tích thể chuyển gen
Ngày nay, khoa học đã có nhiều tiến bộ trong chuyển gen ở thực vật nói chung
và cây đậu tương nói riêng. Sự tiến bộ kỹ thuật thể hiện ở nhiều khâu như phát triển vector phù hợp với hệ thống sinh mới, tiện lợi cho việc sàng lọc, đánh giá; hoàn
thiện các phương pháp chuyển gen trực tiếp và gián tiếp; hoàn thiện hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen cho từng đối tượng; ứng dụng nhiều phương pháp phân
tích gen ngoại lai ở thể tái tổ hợp qua nhiều thế hệ... Nhờ những tiến bộ kỹ thuật ngày càng hoàn thiện trong chuyển gen đã nâng cao hiệu suất và rút ngắn thời gian chọn tạo cây trồng biến đổi gen đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của sản suất nông nghiệp.
Gần đây dữ liệu hệ gen học (Genomics Data) được phát triển dựa trên những thông tin về trình tự các gen trong hệ gen của cây cây trồng và một lượng lớn thông tin về giải mã hệgen cây đậu tương có thể tìm thấy ở Ngân hàng gen quốc tế. Ngoài ra, nguồn thông tin khác cũng được phát triển, như dữ liệu EST (expressed
sequence tag), thư viện cDNA... Những nguồn thông tin này là cơ hội của việc ứng dụng các tiến bộ chọn giống đậu tương bằng chỉ thị phân tử và kỹ thuật chuyển gen,
là cơ sở của những hiểu biết về chức năng gen trên cơ sở tách dòng gen và phương
pháp di truyền ngược. Trên cơ sở đó, nghiên cứu xây dựng một quy trình hệ thống chuyển gen ổn định và có hiệu quả ở cây đậu tương là điều cần thiết đi tới thành công trong chiến lược chọn giống bằng kỹ thuật chuyển gen.
Chuyển gen được hiểu đầy đủ là: gen ngoại lai (gen chuyển) phải được hợp nhất vào hệ gen tế bào chủ; gen chuyển phải được biểu hiện ở tế bào chủ; gen chuyển phải được di truyền cho các thế hệ sau, trong mỗi thế hệ sản phẩm của gen chuyển phải được biểu hiện và sản phẩm biểu hiện của gen chuyển phải thể hiện
được chức năng sinh học. Vì vậy quá trình chọn lọc, phân tích cây chuyển gen trong mỗi thế hệ được thực hiện bằng hệ thống chọn lọc tế bào và mô chuyển gen, xác
định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chủ, kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu hiện là mRNA, protein và phân tích sự
biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển. Có thể mô tả khái quát các thí nghiệm phân tích cây chuyển gen ởsơ đồ hình 1.5.
Chọn lọc thể chuyển gen bằng gen chỉ thị
Hầu hết các vector chuyển gen đều được thiết kế hệ thống gen chọn lọc kèm
theo gen đích cho phép sàng lọc các mô, cây mang gen ở giai đoạn sớm bằng biểu hiện kháng của gen đó với các chất chọn lọc [17] hoặc kháng vi khuẩn Alternaria solani [39]. Các gen chọn lọc có thể là các gen kháng chất kháng sinh, kháng chất diệt cỏ, gen chỉ thị màu hoặc gen chuyển hóa các cơ chất chọn lọc. Thực chất phân tích tính kháng của chất chọn lọc (kháng sinh, chất diệt cỏ) là chọn dòng tế bào, mô và cây mang tính kháng với chất chọn lọc thông qua hoạt động của gen chỉ thị cho chọn lọc. Chất chọn lọc có thểlà kháng sinh như kanamycin khi dùng gen nptII hay hygromycin khi dùng gen hpt hoặc thuốc diệt cỏ basta khi dùng gen bar [17], [23].
Hình 1.5. Sơ đồcác phương pháp phân tích cây chuyển gen
Bước phân tích này có thể áp dụng cho mọi giai đoạn sau khi biến nạp từ trạng
thái đơn bào đến mô sẹo, chồi tái sinh cây hoàn chỉnh hay cây non gieo từ hạt. Cách thức tiến hành đơn giản: chỉ bổ sung chất theo nồng độ nhất định vào môi trường nuôi cấy rồi quan sát ảnh hưởng của chất chọn lọc lên mô hoặc cây. Biểu hiện
chuyển màu nâu đen và chết. Còn chồi sẽ không thể tạo rễ nếu không mang gen chuyển mặc dù được chuyển sang môi trường có nồng độ chất kích thích ra rễ cao vì bộ rễ rất nhạy cảm với chất chọn lọc [4], [17].
Gen chỉ thị chọn lọc có thể sử dụng là gen chuyển hoá gây biến đổi màu sắc cơ
chất để phát hiện thể tái tổ hợp (GUS, GFP). Hệ thống gen gus (gus, gusA và uidA) mã hóa cho β-glucuronidase lần đầu tiên được phân lập từ E.coli [63] và ngay sau khi phát hiện, nó nhanh chóng được phát triển thành hệ thống chỉ thị cho chuyển gen ở thực vật [64]. Ngày nay, việc sử dụng gen gus trong chuyển gen thực vật ngày càng rộng rãi, nhất là trong những thí nghiệm khảo sát quy trình chuyển gen vào một giống cây mới [64], [125].
Phân tích cây chuyển gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử
Gen ngoại lai sau khi được biến nạp vào tế bào có thể tồn tại trong tế bào chủ ở 3 trạng thái: (1) tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) tồn tại lâu dài dưới dạng một thể plasmid độc lập; (3) ổn định như một đoạn DNA của hệ gen trong tế bào chủ và
được nhân lên trong tế bào chủ. Dạng thứ 3 là trạng thái mong muốn nhất khi tạo cây chuyển gen vì tính bền vững của thể biến nạp. Các kỹ thuật sinh học phân tửđã
được ứng dụng nhằm xác định sự có mặt, sự di truyền và sự biểu hiện của gen chuyển trong tế bào chủ (Hình 1.5).
Đểxác định sự có mặt của gen chuyển có thể sử dụng kỹ thuật PCR; kỹ thuật
lai Southern xác định số bản sao (copy) trong cây chuyển gen là phương pháp tin
cậy và thông dụng. Gần đây, một kỹ thuật thường sử dụng trong việc phát hiện số (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bản sao trong cây chuyển gen là Quantitative Real-time PCR (Q-PCR). Q-PCR có thể tiến hành với số lượng cây cần phân tích nhiều, do dễ thực hiện, tiết kiệm nguyên liệu chi phí và công sức. Năm 2001, Ingham và cs phát triển phương pháp
Real-time PCR xác định số bản copy gen chuyển trong hệ gen của cây trồng và thực vật chuyển gen [61]. Năm 2004, Bubner và cs đánh giá hiệu quả của phương pháp
Real-time PCR trong việc xác định số bản sao ở thực vật chuyển gen khi phân tích kết hợp với kỹ thuật Southern blot [25]. Kể từđó, Real-time PCR được sử dụng phổ
biến trong nhiều nghiên cứu nhằm xác định số bản copy gen chuyển và phát hiện thểđồng hợp, dị hợp ở thực vật chuyển gen [142].
Biểu hiện gen là quá trình hoạt động của gen để tạo ra sản phẩm cuối cùng là protein. Quá trình biểu hiện gen được thể hiện qua hai giai đoạn: phiên mã từ
DNA sang mRNA và dịch mã từ mRNA tổng hợp các phân tử protein thông qua bộ máy ribosome. Để xác định sự có mặt sản phẩm phiên mã của gen ngoại lai có thể sử dụng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen chuyển và khuôn là cDNA từ RNA tổng số của cây cần kiểm tra. Ngoài ra, có thể sử dụng kỹ thuật lai Northern giữa mẫu dò là đoạn DNA của gen đánh dấu huỳnh quang với RNA toàn phần của mô cây chuyển gen. Một kỹ thuật mới được phát triển gần đây là Real- time RT-PCR nhằm đánh giá mức độ phiên mã cao hay thấp của gen chuyển [22].
Nguyên lý chủ yếu của Real-time RT-PCR là dựa trên cơ sở phát hiện và định
lượng tín hiệu phát xạ thông báo huỳnh quang. Hàm lượng sản phẩm PCR bắt đầu
được tăng cao lên từ chu kỳngưỡng (Ct) tương quan chặt chẽ với hàm lượng cDNA
khuôn ban đầu. Để sử dụng Real-time RT-PCR trong xác định mức độ biểu hiện của gen chuyển, người ta dựa vào mối tương quan giữa giá trị Ct và số copy trong cDNA mẫu ban đầu. Có nhiều phương pháp khác nhau đã được thử nghiệm, có thể
so sánh Ct đo được với đường chuẩn thu được từ các nồng độ pha loãng khác nhau của một plasmid mang trình tự gen chuyển mà đã biết trọng lượng phân tử và nồng
độ DNA chính xác, từđó tính tương đối số copy của mẫu cần kiểm tra. Một phương
pháp khác tương đối phổ biến và hiệu quả trong việc xác định mức độ biểu hiện gen chuyển bằng Real-time PCR là phương pháp dựa vào giá trị Ct tương đối (2-ΔΔCt).
Phương pháp này dựa vào ΔCt là độ chênh lệch giữa Ct của cây chuyển gen và Ct của mẫu chuẩn là mẫu mang gen nội sinh (housekeeping gene) biểu hiện ổn định trong tất cả các mô bào ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Trong cùng một phản
ứng Real-time RT-PCR với hiệu suất như nhau, bằng cách làm chuẩn nồng độ
cDNA ban đầu đưa vào phản ứng, các mẫu có mức độ biểu hiện gen chuyển khác nhau sẽ cho giá trị ΔCt khác nhau [83]. Hiện nay, kỹ thuật Real-time RT-PCR được thử nghiệm ứng dụng trong lĩnh vực phát hiện, xác định mức độ biểu hiện của gen và theo dõi hiệu quảđiều trị ở bệnh nhân ung thư [131] và phát hiện và định lượng sinh vật biến đổi gen [26].
Một hướng phát triển mới của kỹ thuật Real-time RT-PCR là phân tích chức
năng gen bằng cách định lượng trực tiếp sản phẩm của gen trên các giống đậu tương trong điều kiện bất lợi. Theo hướng này, sản phẩm phiên mã của các gen điều hoà hoặc các gen chức năng (như TCSs, GmNAC...) được định lượng trực tiếp và so sánh giữa các giống đậu tương khác nhau trong cùng điều kiện bất lợi (hạn, lạnh, mặn...) bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR. Kỹ thuật này cho phép vừa khẳng định
được vai trò hoạt động của gen trong điều kiện hạn, vừa xác định được mức độ phản
ứng với hạn của mỗi giống đậu tương. Từđó đánh giá được tiềm năng di truyền của các giống đậu tương có thể sử dụng trong kỹ thuật gen nhằm cải thiện đặc tính chịu hạn [71], [102], [118], [121].
Thực hiện xác định hoạt động của gen chuyển tạo sản phẩm cuối cùng bằng kỹ
thuật lai Western giữa protein của cây chuyển gen với kháng thể đặc hiệu. Một kỹ
thuật khác là ELISA phát triển dựa trên nguyên lý ngưng kết kháng nguyên - kháng thể và phản ứng tạo màu của cơ chất với enzyme gắn trên kháng thể đặc hiệu. ELISA cho phép phát hiện và xác định được mức độ dịch mã nhờ định lượng protein ngoại lai bằng phương pháp so màu [19], [22].
Ngoài ra, cần xác định sựổn định di truyền của tính trạng được xác định bởi gen chuyển bằng các phương pháp kiểm tra, đánh giá trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng. Giai đoạn này cần phân tích dựa vào sự biểu hiện tính trạng quan tâm hay chức năng sinh học của gen chuyển, qua đó xác định khả năng di truyền, chọn lọc dòng đồng hợp tử về gen chuyển quan tâm nhằm tạo dòng hoặc giống ổn định.
Nhờ ứng dụng những tiến bộ trong kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn A.