5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
3.3.2. Gắn cấu trúc chứa gen GmEXP1 vào vector pCB301 tạo vector chuyển
gen GmEXP1
Sau khi tạo được cấu trúc gen GmEXP1 đầy đủ các thành phần cần thiết cho biểu hiện và kiểm tra hoạt động của gen, việc tiếp theo là gắn cấu trúc này vào vector chuyển gen phù hợp để có thể biến nạp được vào hệ gen thực vật. Vector
pCB301 được lựa chọn vì mang những đặc điểm phù hợp, như: có điểm cắt của enzyme phù hợp, giữa left boder (LB) và righ boder (RB) có gen kháng kanamycin hoạt động trong tế bào thực vật nhờ Nos promoter và Nos terminator, có điểm khởi
động tái bản oriV trong vi khuẩn, có gen chọn lọc kháng kanamycin hoạt động trong vi khuẩn, có operon TrfA mang các gen vir đảm trách quá trình chuyển gen từ vi khuẩn vào hệ gen thực vật và một số thành phần khác.
Việc gắn cấu trúc gen GmEXP1 vào vector chuyển gen pCB301 được thực hiện bởi các phản ứng: thu nhận cấu trúc gen GmEXP1 bằng enzyme giới hạn, cắt mở vòng vector pCB301 và gắn cấu trúc gen GmEXP1 tạo vector chuyển gen.
Thu nhận cấu trúc chứa gen GmEXP1
A B
Hình 3.7. Sơđồ sản phẩm cắt plasmid bằng HindIII thu nhận cấu trúc chứa gen GmEXP1 (A)
và hình ảnh điện di sản phẩm DNA đích đã tinh sạch từ vector pCB301 cắt bởi HindIII (B)
M: thang chuẩn DNA 1kb; 1: sản phẩm cắt bởi HindIII; ĐC: plasmid không cắt bởi HindIII;
SP: Sản phẩm DNA đích mở vòng từvector pCB301 đã tinh sạch
Gen GmEXP1 và các thành phần như CaMV35S, c-myc, và polyA có kích thước là 1624 bp, ởhai đầu là điểm cắt của enzyme giới hạn HindIII. Khi sử dụng HindIII xử
lý vector tái tổ hợp pRTRA_GmEXP1 sẽ thu nhận được cấu trúc chứa gen GmEXP1
dài 1624 kb và phần còn lại của vector pRTRA7/3 dài 2388 bp.
Điện di sản phẩm cắt hạn chế trên gel agarose (Hình 3.7A) nhận được 3 băng DNA trong đó 2 băng có kích thước khoảng 1,6 và 2,4 kb tương ứng với kích thước
tính toán. Băng DNA trên cùng có kích thước khoảng 4,0 kb tương ứng với kích
thước của pRTRA7/3_GmEXP1. Băng có kích thước khoảng 1,6 kb được tinh sạch
để thu nhận cấu trúc chứa gen GmEXP1cho bước phát triển vector tiếp theo.
Cắt mở vòng vector pCB301
Vùng MCS của vector pCB301 có hai điểm cắt của enzyme HindIII cách nhau 60 bp. Sử dụng enzyme HindIII xử lý vector chuyển gen pCB301 có thể nhận được
hai phân đoạn DNA với kích thước 5502 bp và 60 bp, trong đó phân đoạn 5502 bp chính là vector mở vòng cần thu nhận phục vụ thiết kế vector chuyển gen.
Điện di sản phẩm tinh sạch sau khi cắt mở vòng plasmid pCB301 trên gel
agarose 0,8% thu được băng DNA có kích thước khoảng 5,5 kb (Hình 3.7B) phù hợp với kích thước đã tính toán. Trên gel điện di xuất hiện một băng duy nhất, không có sản phẩm phụ hay trạng thái đứt gãy của DNA. Sản phẩm DNA tinh sạch
đảm bảo sử dụng tốt cho phát triển vector chuyển gen.
Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1
Sử dụng T4 ligase để gắn cấu trúc CaMV35S_GmEXP1_c-myc_polyA vào plasmid pCB301 mở vòng. Sản phẩm tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến E.coliDH5α bằng sốc nhiệt để chọn lọc và nhân dòng nhờ colony-PCR. Vi khuẩn sau khi biến nạp được nuôi trên môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin. Trên môi trường nuôi cấy sau 16 giờ ở 37oC xuất hiện nhiều khuẩn lạc của vi khuẩn E.coli. Mỗi dòng khuẩn lạc này có thể mang một trong hai (hoặc cả
hai) dạng plasmid là pCB301_GmEXP1 hoặc pCB301 tự đóng vòng. Thực hiện colony-PCR một số khuẩn lạc với cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI để lựa chọn dòng vi khuẩn mang vector chuyển gen GmEXP1, kết quả thể hiện ở hình 3.8A.
Kết quả colony-PCR (Hình 3.8A) cho thấy, các dòng khuẩn lạc 1 và 4 âm tính (không xuất hiện băng đặc hiệu) có thể do chứa plasmid pCB301 tự đóng vòng,
kháng được kanamycin nhưng không mang cấu trúc gen GmEXP1. Các dòng khuẩn lạc 2, 3, 5 và 6 dương tính với phản ứng với phản ứng colony-PCR (xuất hiện băng đặc hiệu khoảng 0,78kb) có thể chứa plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen
GmEXP1. Những dòng khuẩn lạc dương tính này được nuôi trong LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc (kanamycin) để nhân dòng vector tái tổ hợp cho biến nạp vào
A.tumefaciens phục vụ chuyển gen.
A B
Hình 3.8. Kết quảđiện di sản phẩm colony-PCR bằng mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI
chọn dòng vi khuẩn E.coli (A) và A.tumefaciens (B) mang vector chuyển gen
M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 6: PCR các dòng khuẩn lạc; (+): PCR gen GmEXP1; (-): colony-PCR trên khuẩn không biến nạp
Tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen GmEXP1
Plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen GmEXP1 tách từ sinh khối vi khuẩn
E.coli được biến nạp vào A.tumefaciens CV58 bằng kỹ thuật xung điện. Sản phẩm biến nạp sau khi nuôi phục hồi trong LB lỏng được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin và rifamycin. Sau khi nuôi 48 giờ ở
28oC, các khuẩn lạc xuất hiện trên mặt thạch được colony-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI để lựa chọn dòng khuẩn lạc mang vector chuyển gen GmEXP.
Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR (Hình 3.8B) cho thấy, cả ba dòng khuẩn lạc kiểm tra đều dương tính, trên gel điện di xuất hiện một băng đặc hiệu duy nhất với kích thước khoảng 0,78kb tương ứng với kích thước của băng xuất hiện
ở giếng đối chứng dương (sản phẩm PCR gen GmEXP1). Điều đó chỉ ra rằng, ba dòng vi khuẩn A.tumefaciens kiểm tra đều mang vector chuyển gen GmEXP1.
Các dòng vi khuẩn dương tính với colony-PCR được nhân lên trong LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin và rifamycin để thu sinh khối phục vụ
chuyển gen vào thực vật.
Kiểm tra vector chuyển gen GmEXP1 bằng enzyme hạn chế NotI
Để khẳng định chắc chắn sự có mặt của cấu trúc gen GmEXP1 trên vector pCB301, chúng tôi thực hiện cắt plasmid tái tổ hợp thu nhận từ sinh khối các dòng vi khuẩn bằng enzyme hạn chếNotI. Trong cấu trúc của pCB301 chứa một điểm cắt của NotI tại vị trí thứ 99 - cách HindIII là 306 bp. Trong cấu trúc gen chuyển
GmEXP1 cũng chứa một điểm cắt giới hạn của enzyme NotI nằm giữa GmEXP1 và c-myc. Khi xử lý vector tái tổ hợp bằng NotI, tuỳ cách gắn của cấu trúc gen
GmEXP1 ở dạng gắn xuôi hay gắn ngược mà cho các phân đoạn DNA dài ngắn khác nhau.
Quá trình tạo pCB301_GmEXP1 chỉ sử dụng một loại enzyme giới hạn là
HindIII tạo các đầu dính giống nhau nên việc gắn của đoạn nạp vào vector mở vòng có thể xảy ra hai khảnăng là gắn xuôi và gắn ngược.
Hình 3.9. Sơ đồ kiểm tra gen GmEXP1 trên vector chuyển gen bằng NotI
A: Cấu trúc chứa gen chuyển gắn xuôi chiều; B: Cấu trúc chứa gen chuyển gắn ngược chiều;
C: hình ảnh điện di sản phẩn cắt plasmid tái tổ hợp bằng NotI; M: thang chuẩn DNA 1kb;
Nếu cấu trúc gen chuyển gắn thuận chiều vào pCB301, hai điểm tương tác
NotI nằm gần nhau và kết quả cắt sẽ cho hai phân đoạn DNA kích thước 606 và 6516 bp (Hình 3.9A). Ngược lại, nếu gắn ngược chiều lên pCB301, hai điểm NotI nằm xa nhau và kết quả cắt sẽcho hai phân đoạn DNA kích thước 1630 và 4592 bp (Hình 3.9B).
Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid (Hình 3.9C) cho thấy, cả ba dòng vi khuẩn đều mang cấu trúc gen GmEXP1; dòng vi khuẩn 1 xuất hiện hai băng kích thước khoảng 1,6 bp và 5,5 bp chứng tỏ cấu trúc gen GmEXP1 đã gắn ngược chiều lên pCB301; dòng 2 và 3 xuất hiện hai băng trên gel điện di là 0,6 bp và 6,5 bp chứng tỏ cấu trúc gen GmEXP1 đã gắn xuôi chiều vào pCB301. Bất kểphương thức gắn xuôi hay ngược lên pCB301, gen GmEXP1 vẫn được khởi động phiên mã bởi CaMV35S trong tế bào thực vật. Cho đến nay chưa tìm được công bố nào chứng minh hiệu quả của gắn xuôi chiều hay ngược chiều có ảnh hưởng đến hiệu quả
chuyển gen hay khảnăng biểu hiện của gen chuyển.
Kết quả kiểm tra bằng enzyme hạn chế NotI cho phép khẳng định sự thành công của quá trình phát triển vector chuyển gen GmEXP1. Vi khuẩn A. tumefaciens
(dòng số 3) mang vector chuyển gen đã kiểm tra được sử dụng để chuyển gen vào tế
bào thực vật qua lây nhiễm.
3.4.KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GEN GmEXP1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ
3.4.1.Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây thuốc lá nhờ A. tumefaciens
Tiến hành chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây thuốc lá N. tabacum
K326 thông qua chủng vi khuẩn A. tumefaciens CV58 mang vector chuyển gen. Chuẩn bị vật liệu cây thuốc lá gieo trồng in vitro sau khi đã khử trùng hạt (Hình 3.10A). Mô đích sử dụng là các mảnh lá (khoảng 1cm2) đã được gây tổn thương và
nuôi cấy trên môi trường cảm ứng MS trước khi biến nạp 48 giờ.
Tiến hành biến nạp bằng cách ngâm các mảnh lá đã chuẩn bị trong dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens trong 20 phút (Hình 3.10B). Các mảnh lá sau
hai ngày đồng nuôi cấy trong tối, được rửa khuẩn bằng kháng sinh cefotaxim và
được đặt lên môi trường tạo đa chồi MS có bổ sung cefotaxim, kanamycin và BAP 1 (Hình 3.10C).
Sau 2-3 tuần từ các mảnh lá xuất hiện các cụm chồi nhỏ (Hình 3.10D). Những chồi xanh có thể mang cấu trúc gen chuyển, kháng được kháng sinh chọn lọc nên phát triển xanh tốt. Những chồi vàng úa, héo có thể không mang cấu trúc gen chuyển nên bị kháng sinh chọn lọc đào thải. Các chồi xanh tốt được tách từ
cụm chồi và cấy lên môi trường MS bổ sung chứa kháng sinh chọn lọc để kéo dài chồi (Hình 3.10E). Sau 1-2 tuần, các chồi này được cấy chuyển sang môi
trường ra rễ RM (Hình 3.10F). Các cây ra rễ, khoẻ mạnh sau 1 - 2 tuần được đưa ra
bầu trấu cát (Hình 3.10G) và ra nhà lưới (Hình 3.10H).
Hình 3.10. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen A: Cây thuốc lá gieo trồng in vitrođể thu mảnh lá vô trùng dùng cho biến nạp; B: Mảnh lá ngâm
trong dịch huyền phù vi khuẩn mang vector chuyển gen; C: Mảnh lá trên môi trường đồng nuôi cấy; D:Tái sinh đa chồi; E: Kéo dài chồi; F: Tạo rễ; G: Ra bầu trấu cát; H:Ra nhà lưới
Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy, sau 2 lần biến nạp, với 60 mảnh lá cây thuốc lá K326 có 59 mảnh sống sót. Các cụm chồi hình thành được đưa sang môi trường chọn lọc và kéo dài chồi. Số các cây sống sót được đưa vào môi trường ra rễ là 175. Số cây ra rễ sống sót in vitro được đưa ra bầu đất là 149 và chọn lựa 44 cây khoẻ
mạnh ra nhà lưới. Lô không chuyển gen (ĐC1) cũng lựa chọn 15 cây xanh tốt, khoẻ
Các cây thuốc lá chuyển gen sau khi trồng trong nhà lưới được khoảng 4 tuần thì tiến hành thu mẫu lá để phân tích, kiểm tra sự có mặt và hoạt động của gen chuyển GmEXP1.
Bảng 3.6. Thống kê sốlượng các mẫu chuyển gen vào cây thuốc lá mô hình N. tabacum
Lô thí nghiệm Số mẫu thí nghiệm Số mẫu sống sót tạo cụm chồi Số cây sống sót ra rễ Số cây ra bầu đất Số cây ra nhà lưới Lần 1 30 30 88 74 21 Lần 2 30 29 87 75 23 ĐC0* 30 0 0 0 0 ĐC1* 30 30 103 15 15
Ghi chú: * ĐC0 là thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh;
* ĐC1 là thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh.