5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
3.4.3. Phân tích và đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển
GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế hệ T1
3.4.3.1.Chọn lọc cây thuốc lá T1 mang gen chuyển bằng kháng sinh
Hạt của cây T0 được gieo trên môi trường MS có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin. Những hạt nảy mầm và phát triển được trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc có khảnăng mang cấu trúc gen GmEXP1 và biểu hiện sản phẩm.
Hình 3.16. Hạt thuốc lá gieo trên môi trường MS không kháng sinh (A) và có kháng sinh chọn lọc kanamycin (B)
26, 30, 36: hạt các cây thuốc lá chuyển gen tương ứng; wt: hạt cây thuốc lá không chuyển gen
Hạt của hai cây thuốc lá chuyển gen 26 và 30 và hạt cây không chuyển gen khi
gieo trên môi trường không kháng sinh đều nảy mầm, sinh trưởng bình thường (Hình 3.16A); riêng hạt của cây chuyển gen số 36 bị mất khả năng nảy mầm. Trên
môi trường chứa kháng sinh chọn lọc, hạt của hai cây thuốc lá chuyển gen số 26 và 30 nảy mầm và phát triển bình thường; hạt cây không chuyển gen và hạt cây chuyển gen cây số 36 không nảy mầm (Hình 3.16B). Hạt cây không chuyển gen không có hoạt tính kháng lại kháng sinh chọn lọc kanamycin, do đó bịđào thải.
Các cây T sống sót và phát triển trên môi trường MS có kháng sinh chọn lọc
được ưu tiên phát triển và sử dụng để phân tích mức độ hoạt động phiên mã của gen chuyển bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR; phân tích protein ngoại lai expansin bằng kỹ thuật Western blot và đưa vào hệ thống gây hạn nhân tạo đểđánh giá chức năng
sinh học của gen chuyển.
3.4.3.2.Đánh giá mức độ phiên mã gen chuyển trên các cây thuốc lá chuyển gen T1 bằng Real-time RT-PCR
Chuẩn bị mẫu cho phản ứng Real-time RT-PCR
Vì hạt của cây chuyển gen số 36 bị mất khảnăng nảy mầm nên phân tích mức
độ phiên mã bằng Real-time RT-PCR chỉ được tiến hành ở các cây thuốc lá thế hệ
T1 trên các dòng số 26 và 30. Tiến hành thu mẫu lá các cây thuốc lá chuyển gen T1
và tách RNA tổng số, tổng hợp cDNA để chuẩn bị mẫu cho phản ứng.
Trước khi tiến hành phản ứng Real-time RT-PCR, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự bắt cặp của mồi và khuôn cDNA của cây thuốc lá T1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi qEXP1-F/qEXP1-R đã thiết kế. Bước kiểm tra này đồng thời cũng sàng lọc loại trừ các cây T1 không mang gen chuyển GmEXP1để tiết kiệm phản ứng Real-time. Kết quảđiện di sản phẩm PCR trên gel agarose thể hiện ở hình 3.17.
Hình 3.17. Kết quảđiện di sản phẩm khuếch đại từ gen GmEXP1 ở các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1
26.1 - 26.5: Các cây chuyển gen thuộc dòng 26; 30.1 - 30.5: Các cây chuyển gen thuộc dòng 30
Kết quả kiểm tra và sàng lọc cây thuốc lá chuyển gen T1 bằng RT-PCR với cặp mồi qEXP1-F/qEXP1-R (Hình 3.17) cho thấy, 4/5 cây thuộc dòng 26 và 5/5 cây thuộc dòng 30 xuất hiện băng DNA kích thước khoảng 133 bp, nghĩa là có phản
ứng dương tính. Các mẫu cDNA thuộc các dòng cây phản ứng dương tính nói trên được sử dụng cho phản ứng Real-time RT-PCR để phân tích mức độ phiên mã của gen chuyển GmEXP1.
Kết quả phân tích mức độ phiên mã bằng Real-time RT-PCR
Tương tự như đối với các cây thuốc lá T0, phản ứng Real-time RT-PCR trên mẫu các cây thuốc lá chuyển gen T1thu được đồ thị các đường biểu diễn sự khuếch
đại cDNA của gen tham chiếu actin và gen chuyển GmEXP1 tương ứng với các giá trị Ct. Đồ thị phân tích nhiệt độ chảy và đỉnh chảy cũng thể hiện hai mức nhiệt là 82oC (của gen chuyển GmEXP1) và 84oC (của gen tham chiếu actin). Qua đó cho
phép khẳng định chỉ có hai loại sản phẩm DNA được khuếch đại trong mỗi ống phản ứng Real-time; không có sản phẩm phụ không đặc hiệu nên không làm giảm hiệu suất của phản ứng Real-time (Phụ lục 3). Như vậy có thể sử dụng số liệu của những phản ứng Real-time trên để phân tích mức độ sai khác trong phiên mã của gen chuyển GmEXP1 ở các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1.
Bảng 3.8. Kết quả phân tích chu kỳngưỡng và tỷ lệ biểu hiện của gen GmEXP1 ở các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 so với cây T026
Mẫu Ct_EXP1 Ct_Actin ΔCt(T) ΔCt(C) ΔΔCt R/T026 Cây 26-1 21,27 23,35 -2,08 -0,08 1,05 Cây 26-2 21,79 23,89 -2,10 -0,09 1,07 Cây 26-3 21,76 23,47 -1,71 0,29 0,82 Cây 26-4 20,05 22,90 -2,85 -0,84 1,79 Cây 30-1 21,29 22,97 -1,68 0,33 0,80 Cây 30-2 20,93 22,66 -1,73 0,28 0,82 Cây 30-3 19,90 22,66 -2,76 -0,75 1,69 Cây 30-4 22,54 24,95 -2,41 -0,40 1,32 Cây T026 21,96 23,97 -2,01 -0,14 1,00
Kết quả tổng hợp các giá trị Ct nhận được qua phản ứng Real-time RT-PCR (Phụ lục 3) và xác định các giá trị ΔCt, ΔΔCt, tỷ lệ biểu hiện R theo phương pháp
của Livak được thể hiện ở bảng 3.8 và biểu đồ hình 3.18.
Hình 3.18. Biểu đồ so sánh tỷ lệ biểu hiện của gen GmEXP1 ở các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 so với mẫu cây chuyển gen T026
Bảng 3.8 và hình 3.18 cho thấy, các cây T1: 26-1, 26-2, 26-3, 30-1, 30-2 có mức độ biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 tương đương với cây T026. Áp dụng
phương pháp phân tích thống kê t-Test đối với mức độ biểu hiện phiên mã của các cây dòng thuốc lá chuyển gen T126 và T130 với mức ý nghĩa α = 0,001. Kết quả
phân tích ở bảng 3.9 cho thấy, giá trị tTN = 0,077 nhỏ hơn giá trị tα so sánh một chiều (10,21) và tα so sánh hai chiều (12,92). Như vậy có thể kết luận rằng gen chuyển của hai dòng thuốc lá chuyển gen T126 và T130 có mức độ biểu hiện ở mức
phiên mã là như nhau với độ tin cậy 99,9%.
Bảng 3.9. Kết quảxác định sự khác biệt về mức độ biểu hiện phiên mã ở hai dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 bằng t-Test (α = 0,001)
Trị số thống kê Dòng chuyển gen T126 Dòng chuyển gen T130
Giá trị trung bình 1,182 1,158
tTN 0,077
t so sánh một chiều 10,215 t so sánh hai chiều 12,924
Bảng 3.8 còn thể hiện các cây 26-4, 30-3, 30-4 có mức độ biểu hiện gen chuyển cao hơn cây T026 từ 1,32 đến 1,79 lần. Nguyên nhân của sự biến động trong biểu hiện phiên mã của gen chuyển GmEXP1 ở mỗi cá thể có thể xuất phát từ sự tương tác của các nhân tố bên trong tếbào như: hiệu quả vị trí của gen chuyển trong bộ NST cây đích; sự thay đổi số lượng copy qua sinh sản hữu tính; hiệu quả biểu hiện gen đích có sựthay đổi trong hệ thống biểu hiện mới ở thế hệ sau.
Qua phân tích có thể thấy, kỹ thuật Real-time RT-PCR có ưu thế là cho phép
xác định mức độ biểu hiện sản phẩm phiên mã của gen ngoại lai ở cơ thể chuyển gen. Nhờ đó có thể sử dụng làm cơ sở để lựa chọn và ưu tiên phát triển những cây chuyển gen có sự biểu hiện gen chuyển ổn định - phù hợp với mục đích chọn tạo cây trồng biến đổi gen.
3.4.3.3.Phân tích protein ngoại lai trên các dòng cây thuốc lá chuyển gen T1 bằng Western blot
Các cây T1 thuộc các dòng thuốc lá chuyển gen số 26 và 30 dương tính với phản ứng RT-PCR được thu lá và chiết protein bằng dịch đệm PBST. Sau khi xác
định hàm lượng protein tổng số trong dung dịch bằng phương pháp Bradford, các
dung dịch được chỉnh về cùng mức nồng độ và điện di biến tính trên SDS-PAGE. Tiếp theo là chuyển protein trên gel điện di lên màng lai nitrocellulose, blocking với sữa tách béo và thực hiện lai kháng thể 1, lai kháng thể 2; cuối cùng là hiện màu với cơ chất DAB. Kết quả phản ứng Western blot thể hiện ở hình 3.19.
Hình 3.19. Kết quả lai Western các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1
1 - 4: Các cây chuyển gen dòng số 26; 5 - 8: Các cây chuyển gen dòng số 30; wt: Cây thuốc lá không chuyển gen làm đối chứng âm; (+): Protein cây chuyển gen T026 làm đối chứng dương;
Trên màng lai nitrocellulose (Hình 3.19), tại các làn điện di protein cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 đều xuất hiện một băng màu ở vị trí kích thước khoảng 30 kDa trùng với vị trí băng màu xuất hiện ởlàn đối chứng dương (protein cây chuyển gen 26 thế hệ T0). Làn điện di protein tổng số của cây không chuyển gen (wt) làm
đối chứng âm không xuất hiện băng màu ở vị trí tương ứng. Điều đó chỉ ra rằng, các cây thuốc lá chuyển gen dòng 26 và 30 thuộc thế hệ T1 đã kiểm tra đều có protein ngoại lai expansin được sinh tổng hợp nhờ gen chuyển GmEXP1.
Như vậy có thể nói, gen ngoại lai GmEXP1 phân lập từ giống đậu tương SL1 đã được chuyển thành công vào cây thuốc lá, di truyền và biểu hiện ổn định đến mức độ dịch mã qua hai thế hệ T0 và T1.
3.4.3.4.Đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế hệ T1
Hạt của các dòng thuốc lá chuyển gen T0 dương tính với phản ứng RT-PCR
được sàng lọc bằng cách cho nảy mầm trên môi trường MS chứa kháng sinh chọn lọc kanamycin; hạt thuốc lá không chuyển gen cùng được gieo trên MS nhưng
không bổ sung kháng sinh chọn lọc đểlàm đối chứng.
Hình 3.20. Hình ảnh thí nghiệm gây hạn nhân tạo cây thuốc lá (A) và so sánh hình thái rễ cây
có tưới nước và cây không tưới nước (B) ởgiai đoạn 5 ngày gây hạn WT: Cây thuốc lá đối chứng không chuyển gen; 26, 30: Các dòng thuốc lá chuyển gen
Những cây con T1 nảy mầm, ra rễ và sống sót trên môi trường kháng sinh chọn lọc là nhờ hoạt động của gen chọn lọc nptII có thể kèm theo gen chuyển
GmEXP1. Đến giai đoạn 2 lá thật, các cây con được chuyển sang hệ thống chậu cát
vàng; khi đạt 3 - 4 lá thật thì bắt đầu đánh giá khảnăng phát triển bộ rễ qua các giai
đoạn 3, 5, 7, 9 ngày gây hạn nhân tạo.
Kết quả phân tích khối lượng chất khô của bộ rễ các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệT1
Sau khi sấy khô ở 65oC đến khi khối lượng không đổi, bộ rễ của các cây thuốc
lá được xác định khối lượng chất khô bằng cân phân tích và thực hiện so sánh giữa các dòng thuốc ở các lô thí nghiệm và đối chứng lần lượt qua từng giai đoạn gây hạn; kết quả thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Khối lượng chất khô của bộ rễ các dòng thuốc lá sau 3, 5, 7 và 9 ngày hạn
(n = 30; đơn vị: mg)
Thời gian gây hạn
Cây WT Dòng 26 Dòng 30 % so với WT % so với WT 3 ngày TN 13,68±0,31 19,72±0,45 130,64 20,03±0,50 131,72 ĐC 13,32±0,17 18,90±0,44 129,52 19,14±0,51 130,42 % so với ĐC 102,71 104,36 104,66 5 ngày TN 14,79±0,32 22,00±0,51 132,79 22,37±0,64 133,88 ĐC 14,15±0,20 20,42±0,52 130,73 20,67±0,68 131,56 % so với ĐC 104,52 107,73 108,20 7 ngày TN 15,95±0,45 25,57±0,64 137,64 26,15±0,64 139,02 ĐC 15,04±0,20 22,17±0,58 132,19 22,32±0,79 132,64 % so với ĐC 106,06 115,33 117,15 9 ngày TN 16,94±0,47 27,58±0,64 138,60 28,08±0,84 139,69 ĐC 15,93±0,23 23,77±0,60 133,00 23,92±0,86 133,41 % so với ĐC 106,33 116,02 117,41
Khối lượng chất khô của bộ rễ các dòng thuốc lá sau các giai đoạn 3, 5, 7 và 9 ngày gây hạn nhìn chung đều tăng so với đối chứng. Tỷ lệ khối lượng chất khô của bộ rễ so với đối chứng ở cây không chuyển gen tăng không đáng kể (từ102,71 đến
106,33%); trong khi đó ở các dòng chuyển gen, tỷ lệ này tăng từ 104,36 đến 117,41%. Sựtăng về khối lượng chất khô bộ rễ có thể coi là kết quả của sự cảm ứng
ở thực vật với điều kiện hạn nhằm giữnước trong tếbào đồng thời thay đổi áp suất thẩm thấu để hấp thu được nhiều nước hơn.
So sánh khối lượng chất khô bộ rễ của các cây thuốc lá chuyển gen GmEXP1
với cây không chuyển gen cho thấy trong điều kiện bình thường, tỷ lệ tăng đạt khoảng 33,00 đến 33,41%; trong điều kiện gây hạn nhân tạo, tỷ lệ tăng mạnh đạt khoảng 38,60 đến 39,69%. Sự tăng về khối lượng chất khô của bộ rễ cây thuốc lá chuyển gen so với cây không chuyển gen cảtrong điều kiện gây hạn lẫn trong điều kiện bình thường chứng tỏ gen chuyển GmEXP1 ít nhiều có ảnh hưởng tới sự tích luỹ chất khô của bộ rễ thực vật.
Kết quả phân tích thể tích bộ rễ của các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1
Thể tích bộ rễ của các dòng thuốc lá chuyển gen và không chuyển gen được
xác định và so sánh qua hệ thống gây hạn nhân tạo. Kết quả thể hiện ở bảng 3.11. cho thấy, qua các giai đoạn 3, 5, 7 ngày gây hạn nhân tạo, tỷ lệ thể tích bộ rễ lô thí nghiệm so với lô đối chứng ở các cây thuốc lá chuyển gen dòng 26 tăng từ 105,85
đến 119,13%; dòng 30 tăng từ106,01 đến 120,08% trong khi các cây không chuyển gen chỉ tăng từ 103,14 đến 110,32%. Có thể thấy, trong 5 - 7 ngày mất nước, các cây thuốc lá cảm ứng với hạn, tăng cường tích luỹ chất khô, tăng áp suất thẩm thấu tế bào và hấp thụ nhiều nước dẫn đến tăng thể tích tế bào và cả bộ rễ.
Giai đoạn gây hạn từ 7 - 9 ngày, tỷ lệ thể tích bộ rễ lô thí nghiệm so với lô đối chứng đều giảm xuống ở cả hai dòng thuốc lá chuyển gen và cây thuốc lá không chuyển gen. Thể tích bộ rễ giảm mạnh nhất là ở cây không chuyển gen (110,32 - 97,28 = 13,04%) và tỷ lệ giảm nhẹ nhất là dòng chuyển gen số 30 (120,08 - 107,87 = 12,21%). Sự giảm tỷ lệ thể tích của bộ rễ ở lô thí nghiệm/lô đối chứng trong giai
đoạn này do nhiều nguyên nhân, trong đó rất có thể do khô hạn kéo dài dẫn đến đất thiếu hụt nhiều nước, cây hút được nước ít hơn; sức chống chịu của cây bị giảm và cây mất nước ồạt ở mỗi tế bào và toàn bộcơ thể.
Thời gian gây hạn Cây WT Dòng 26 Dòng 30 % so với WT % so với WT 3 ngày TN 7,41±0,22 10,56±0,47 129,82 10,85±0,41 131,73 ĐC 7,18±0,13 9,97±0,41 127,98 10,24±0,33 129,83 % so với ĐC 103,14 105,85 106,01 5 ngày TN 8,05±0,30 11,84±0,52 132,04 12,17±0,71 133,90 ĐC 7,60±0,15 10,89±0,44 130,21 11,14±0,58 131,79 % so với ĐC 105,85 108,70 109,24 7 ngày TN 8,84±0,32 14,08±0,59 137,24 14,49±0,67 139,01 ĐC 8,01±0,15 11,82±0,76 132,23 12,07±0,48 133,61 % so với ĐC 110,32 119,13 120,08 9 ngày TN 8,25±0,33 13,62±0,64 139,43 14,02±0,77 141,15 ĐC 8,48±0,25 12,75±0,60 133,50 12,99±0,64 134,75 % so với ĐC 97,28 106,81 107,87
(TN: lô thí nghiệm; ĐC: lô đối chứng; WT: kiểu dại - cây không chuyển gen)
So với cây không chuyển gen trong điều kiện phát triển bình thường, các cây thuốc lá chuyển gen GmEXP1 có thể tích bộ rễ lớn hơn cây đối chứng 33,50 -
34,75%; trong điều kiện gây hạn có thểtăng từ 39,43 đến 41,15%. Thể tích bộ rễ ở
cây chuyển gen tăng mạnh hơn so với cây không chuyển gen đã chứng tỏ sự liên quan của gen chuyển tới sựthay đổi thể tích tế bào nói riêng và cả bộ rễ nói chung.
Kết quả phân tích chiều dài rễ chính của bộ rễ các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1
Các cây thuốc lá chuyển gen và không chuyển gen sau các giai đoạn 3, 5, 7, 9 ngày gây hạn nhân tạo được xác định và so sánh chiều dài của rễ chính, kết quả được trình bày ở bảng 3.12.
Thời gian gây hạn Cây WT Dòng 26 Dòng 30 % so với WT % so với WT 3 ngày TN 4,04±0,24 5,86±0,28 131,07 6,22±0,29 135,01 ĐC 3,98±0,18 5,59±0,33 128,86 5,92±0,36 132,85 % so với ĐC 101,59 104,85 104,97 5 ngày TN 4,33±0,23 6,41±0,40 132,45 6,77±0,48 136,03 ĐC 4,21±0,19 6,01±0,39 130,02 6,34±0,35 133,64 % so với ĐC 102,93 106,62 106,77 7 ngày TN 4,81±0,25 7,68±0,56 137,45 8,15±0,59 141,01 ĐC 4,43±0,21 6,43±0,32 131,04 6,76±0,31 134,44 % so với ĐC 108,38 119,50 120,46