5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
1.3.2.Cải thiện khả năng chịu hạ nở cây đậu tương bằng chuyển gen liên quan
đến bộ rễ
Nhằm cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng nói chung trong đó có cây đậu tương, các nghiên cứu thường tập trung theo các bước: phân lập gen và phân tích protein suy diễn nhằm tìm kiếm xác định sơ bộ chức năng gen; phát triển vector chuyển gen và chuyển vào cây mô hình nhằm đánh giá chức năng sinh học của gen
đích; cuối cùng là chuyển vào cây trồng mong muốn cải biến tính trạng.
1.3.2.1.Chuyển gen trong định hướng thay đổi sựtrao đổi chất ở rễđậu tương
Yếu tố ngoại cảnh bất lợi làm giảm năng suất và sản lượng cây trồng. Tạo cây trồng chuyển gen chống chịu các yếu tố ngoại cảnh bất lợi đang được quan tâm của nhiều nhà khoa học [140]. Hai hướng tiếp cận nghiên cứu các gen liên quan đến đặc tính chống chịu các yếu tố bất lợi của ngoại cảnh ở cây đậu tương được quan tâm,
đó là: (1) các gen có sản phẩm là protein điều hòa, kích thích hoặc ức chế nhóm gen chống chịu và (2) các gen mà sản phẩm liên quan trực tiếp đến tính chống chịu.
Thay đổi sự trao đổi chất ở rễ bằng chuyển gen nhằm nâng cao mức biểu hiện của gen mã hoá protein điều hoà
Hệ thống các nhân tố điều hoà ở rễ đậu tương rất đa dạng, gần đây nhiều nhà khoa học quan tâm đến việc phát hiện, phân lập và nghiên cứu hoạt động của chúng
trong các điều kiện bất lợi của môi trường, hướng đến việc cải thiện khảnăng chống chịu của thực vật bằng chuyển gen. Promoter rd29A giữ vai trò cảm ứng và khởi
động gen trong các tế bào mô rễ chống lại yếu tố bất lợi phi sinh học. Năm 2014, de
Paiva Rolla và cs đã chuyển cấu trúc rd29A: AtDREB1A có nguồn gốc từ cây
Arabidopsis thaliana và tạo được dòng cây đậu tương biến đổi gen. Thử nghiệm chức năng sinh học trong điều kiện nhà kính và ngoài đồng ruộng với các chế độ tưới nước khác nhau cho thấy, năng suất của các dòng đậu tương biến đổi gen hầu
như không bịảnh hưởng trong điều kiện nóng và khô hạn [40].
Nghiên cứu chức năng gen GmNFYA3 phân lập từđậu tương trên cây chuyển gen Arabidopsis cho thấy, sản phẩm của gen GmNFYA3tác động mạnh ở rễ cây làm
lợi có liên quan như RD29A, CBF3. Nghiên cứu này mở ra triển vọng trong tạo cây trồng chuyển gen mang gen GmNFYA3tăng cường khảnăng chống chịu hạn [93].
Gen LOS5/ABA3 gián tiếp điều hoà sinh tổng hợp ABA ở Arabidopsis trong
điều kiện bất lợi đã được Li và cs (2013) phân lập và chuyển vào cây đậu tương.
Dòng đậu tương chuyển gen LOS5/ABA3trong điều kiện khô hạn có những phản ứng tích cực chống chịu hạn bằng cách tăng khả năng hấp thụ nước từ đất; giảm kích
thước lỗ khí và giảm tỷ lệthoát hơi nước nên duy trì được lượng nước cao trong lá; lá không héo và quang hợp bình thường. Năng suất hạt đậu tương các dòng chuyển gen
thu được cao hơn đối chứng khoảng 21% khi trồng trong điều kiện khô hạn [78]. Pereira và cs (2011) nghiên cứu xác định mức độ biểu hiện của các nhân tố
phiên mã ở rễ đậu tương thuỷ canh trong điều kiện gây hạn nhân tạo cho thấy, các nhân tố phiên mã MYBJ7, BZIP50, C2H2 và NAC2 đều có xu hướng tăng cường hoạt động qua các khoảng thời gian 25, 50, 75 và 100 phút mất nước. Kết quả
nghiên cứu mở ra khả năng sử dụng các nhân tố phiên mã cảm ứng với hạn trong việc điều khiển những gen chuyển khác thay đổi mức độ biểu hiện đặc hiệu ở bộ rễ trong điều kiện mất nước [100].
Thay đổi sự trao đổi chất ở rễ bằng chuyển gen nhằm nâng cao mức biểu hiện
của gen mã hoá protein chức năng
Gần đây, nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu cơ chế phân tử xác định protein chức năng ở đậu tương liên quan đến chống chịu hạn. Các kết quả nghiên cứu mở ra triển vọng lớn trong việc cải thiện đặc tính chống chịu bất lợi (trong đó
có chịu hạn) của cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen.
Năm 2011, Le và cs nghiên cứu về hệ thống gen hai thành phần (TCS) ở đậu
tương liên quan đến phản ứng chống chịu hạn. Nghiên cứu phát hiện khoảng 83 gen
TCS liên quan đến phản ứng chống mất nước biểu hiện mạnh ở mô rễ. Sản phẩm các gen TCS liên quan đến phản ứng mạnh của cytokinin và ethylen đối với sự mất
nước [71].
Zhang và cs (2010) nghiên cứu đặc điểm gen GmERF4 phân lập từđậu tương
cho thấy, protein hoạt động trên nhân các tế bào mô bì và được tăng cường tổng hợp
trong các điều kiện lạnh, mặn, hạn... Cây thuốc lá chuyển gen GmERF4 tăng khả năng chịu mặn và chịu hạn so với cây đối chứng [145].
P5CS là một trong những enzyme chức năng liên quan đến quá trình tổng hợp proline, một chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu khi cơ thể thực vật sống trong các điều kiện bất lợi như hạn, mặn... Gen P5CS sau khi tạo đột biến điểm ức chế phản hồi đã được sử dụng cho biến nạp làm tăng
khả năng chống chịu khô hạn và mất nước ở một số loại cây trồng trong đó có đậu
tương [9], [144].
Đậu tương chuyển gen P5CR mã hoá l-Δ1-pyrroline-5-carboxylate reductase
xúc tác bước cuối cùng trong sinh tổng hợp proline được điều khiển bởi promoter sốc nhiệt đã làm tăng khả năng chịu hạn và chịu nóng cao hơn so với cây đối chứng [41]. Năm 2009, Valente và cs biểu hiện thành công gen soyBiPD mã hóa chất môi giới phân tửliên quan đến tính chống chịu đã làm chậm quá trình lão hóa các tế bào
lá đậu tương trong điều kiện khô hạn [127].
Phospho đóng vai trò quyết định sự biến đổi vật chất và năng lượng của cơ thể
sống nói chung và thực vật nói riêng. Từ đó quy định chiều hướng, cường độ các quá trình sinh trưởng phát triển và nhiều quá trình sinh lý của cơ thể thực vật, trong
đó có liên quan đến khả năng chịu hạn. Phospho sau khi xâm nhập vào thực vật
dưới dạng các hợp chất vô cơ theo con đường đồng hoá sơ cấp phospho bởi bộ rễ,
đã tham gia vào nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng và tham gia vào hầu hết quá trình
trao đổi chất của cây. Nghiên cứu của Xie và cs (2014) tạo cây đậu tương chuyển gen AtPAP15 (tăng cường tiết apase trong hoạt động trao đổi ion hấp thụ phospho ở
rễ) phân lập từArabidopsis. Kết quả thử nghiệm biểu hiện chức năng sinh học của gen AtPAP15 ở cây Arabidopsis chuyển gen trên một số môi trường nhân tạo đã chứng minh hiệu quả của gen chuyển đến khả năng hấp thụ phospho vô cơ và số lượng rễbên được hình thành cao hơn so với cây đối chứng [137].
1.3.2.2.Chuyển gen trong định hướng thay đổi hình thái bộ rễđậu tương
Năm 2010, Wang và cs chuyển cấu trúc gen 35S-GmWNK1vào cây đậu tương
cho thấy, sản phẩm của gen tương tác với một loại protein đậu tương là CYP707A1 cho hiệu quả làm biến đổi số lượng rễ bên và chiều dài rễ so với cây đối chứng không chuyển gen. Điều đó chứng tỏ vai trò của gen GmWNK1 trong quy định về
kiến trúc hệ thống rễ của cây đậu tương và khảnăng điều khiển hình thái bộ rễđậu
Năm 2010, Ji và cs đã phân lập gen glutathione S-transferase từ cDNA đậu
tương dại (GsGST) và chuyển vào cây thuốc lá. GST là một họprotein đóng vai trò quan trọng trong việc chống oxy hoá và kích hoạt một số enzyme chống chịu quan trọng. Kết quả phân tích dòng thuốc lá chuyển gen T2 cho thấy, khả năng chống chịu hạn và mặn, có sựsinh trưởng kéo dài rễ cũng diễn ra mạnh mẽhơn hẳn so với
cây đối chứng [65].
Nghiên cứu của Guo và cs (2011) trên đậu tương biến đổi gen cho thấy, gen chuyển GmEXPB2 thuộc nhóm β-expansin tham gia vào hệ thống rễ phản ứng với một sốđiều kiện bất lợi phi sinh học, trong đó có liên quan tới sự hình thành và phát triển kéo dài rễ bên, tăng cường hấp thu phospho vô cơ và sắt dẫn đến thay đổi áp suất thẩm thấu của keo nguyên sinh. Đây đều là những phản ứng tích cực của cơ thể
thực vật chống chịu với điều kiện khô hạn [48], [146].
Năm 2014, Quach và cs thực hiện phân tích chức năng các nhân tố phiên mã
GmNAC003 và GmNAC004 của đậu tương trên các dòng cây Arabidopsis chuyển gen cũng cho kết luận về sự ảnh hưởng tích cực của những nhân tố này đối với sự
phát triển kéo dài rễ [102].
Sun và cs (2014) nghiên cứu biểu hiện gen GsGF14o của đậu tương trên cây
Arabidopsisđã xác nhận rằng gen GsGF14oxác định protein GF14o giữ vai trò kép trong chuỗi phản ứng chống chịu hạn thông qua việc điều tiết kích thước lỗ khí và
tăng cường phát triển kéo dài bộ rễ [115].
Năm 2003, Lee và cs đã chứng minh được vai trò của gen GmEXP1 trong việc kéo giãn thành tếbào vùng sinh trưởng rễ trên cây thuốc lá mô hình [72]. Xu và cs (2014) nghiên cứu ảnh hưởng của các gen thuộc nhóm HDG11 tác động nới lỏng thành tế bào thực vật đã chỉ ra vai trò của gen AtEXPA5 của cây Arabadopsis thaliana trong việc kéo giãn thành tế bào theo chiều dọc [138]. Tuy nhiên, tới nay
chưa có công bố về chuyển gen GmEXP1, AtEXPA5 hay gen xác định protein expansin khác nhằm cải thiện khảnăng chịu hạn bằng ảnh hưởng kéo dài rễ của gen
trên cây đậu tương.
Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu phân lập một số gen liên quan
trình tự gen chaperonin từ giống đậu tương chịu lạnh Bonminori - Nhật Bản với kích thước phân tử 1,6kb của Nông Văn Hải và cs (1997) [94]. Trần Thị Phương
Liên và cs (2003) đã phân lập được gen chaperonin CCTδ từ giống đậu tương địa
phương chịu hạn Cúc Vàng, gen này gồm 1602 nucleotid mã hoá cho 533 axit amin [11]. Nguyễn Thị Thuý Hường đã phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan
đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam (2011) [9]. Tổng kết những công trình cho thấy, nghiên cứu cải thiện khảnăng chịu hạn ở cây đậu tương theo hướng cải tiến sự phát triển bộ rễ còn chưa được nhiều các nhà khoa học quan tâm. Sựthay đổi hình thái bộ rễđậu tương trong chuyển gen ở những nghiên cứu nêu trên chỉ là những phát hiện thêm khi thực hiện nghiên cứu chức
năng gen đích. Các kết quả nghiên cứu về bộ rễ đậu tương mới chỉ dừng lại ở mức
độ đánh giá tính trạng và đánh giá tiềm năng di truyền của giống cho sản suất và cho kỹ thuật gen.
Trước những diễn biến phức tạp của biến đổi khí hậu toàn cầu, trước những
khó khăn vùng miền trong sản xuất nông nghiệp của Việt Nam thì việc chọn tạo giống cây trồng phù hợp là rất quan trọng và cần thiết. Tiếp cận ứng dụng công nghệ gen trong chiến lược tạo giống đậu tương chống chịu hạn đang được quan tâm nghiên cứu, trong đó nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen phát triển kéo dài rễ là hướng nghiên cứu chứa đựng đầy tiềm năng trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương.
Chương 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU