5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
3.3.1. Tạo cấu trúc chứa gen đích GmEXP1
Đểgen đích GmEXP1 có thể chuyển vào và hoạt động trong tế bào thực vật thì việc phát triển vector mang cấu trúc gen đích là hết sức cần thiết. Cấu trúc chứa gen
đích bao gồm các thành phần như: promoter khởi động phiên mã gen đích trong tế
bào vật chủ, gen chỉ thị chọn lọc và một số thành phần khác.
Vector trung gian pRTRA7/3 được dùng để cung cấp các thành phần cần thiết cho việc biểu hiện và kiểm tra gen đích GmEXP1 trong tế bào thực vật, như:
CaMV35S là promoter mạnh phân lập từ virus gây khảm súp lơ, có thể khởi động phiên mã gen chuyển ở tất cả các tếbào và mô trên cơ thể thực vật; có đuôi polyA
giúp ổn định cấu trúc phân tử mRNA trong tế bào chất; đặc biệt pRTRA7/3 còn cung cấp trình tựxác định chuỗi peptide c-myc kháng nguyên để có thể dễ dàng xác
định sự có mặt của sản phẩm protein đích khi dùng kháng thể tương ứng bằng Western blot hoặc ELISA.
Việc tạo cấu trúc gen GmEXP1 được thực hiện bằng cách thu nhận GmEXP1
từ pBT tái tổ hợp và xử lý vector pRTRA bằng cặp enzyme hạn chế NcoI/NotI để
tạo các đầu dính tương ứng; sau đó gắn gen đích GmEXP1vào pRTRA đã mở vòng.
Thu nhận gen GmEXP1 từ vector tách dòng pBT
Căn cứ vào kết quả so sánh đánh giá sự biểu hiện tính trạng phát triển của bộ
rễ các giống đậu tương nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn gen GmEXP1 của giống SL1 (giống có bộ rễ phát triển tốt nhất) làm nguyên liệu cho thiết kế vector chuyển gen.
A B C
Hình 3.6. Kết quảđiện đi sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt plasmid bằng NcoI/NotI (A, B) và
sản phẩm colony - PCR chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pRTRA7/3_GmEXP1 (C)
M: thang chuẩn DNA 1kb; SP1: Gen GmEXP1đã tinh sạch sau khi cắt pBT_GmEXP1 bằng
NcoI/NotI; SP2:Đoạn DNA đích đã tinh sạch từ pRTRA7/3 cắt mở vòng bằng NcoI/NotI
Gen GmEXP1 của đậu tương SL1 đã được tách dòng trong vector pBT được cắt bằng hai loại enzyme giới hạn là NcoI và NotI, kết quả tạo ra hai phân đoạn DNA có
kích thước khoảng 0,78 kb và 2,71 kb. Trong đó, phân đoạn DNA 0,78 kb chính là gen GmEXP1 cần thu nhận. Việc sử dụng cặp enzyme hạn chế như trên sẽ đảm bảo
cho gen đích gắn thuận chiều với promoter 35S trên vector tái tổ hợp.
Hình 3.6A thể hiện sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt vector pBT tái tổ hợp bởi cặp enzyme giới hạn NcoI/NotI có kích thước khoảng 0,78kb tương ứng với
kích thước gen GmEXP1 đã ước tính. DNA này được dùng để phát triển vector chuyển gen ởcác bước tiếp theo.
Cắt mở vòng vector pRTRA 7/3
Theo tính toán lý thuyết, nếu sử dụng cặp enzyme giới hạn NcoI và NotI cắt vector pRTRA7/3 thì thu được hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 0,9 kb (là
đoạn 2SP và antiABA không sử dụng) và 3,3 kb. Trong đó phân đoạn 3,3 kb chính
là đoạn pRTRA7/3 mở vòng mang các trình tự cần thu nhận để phát triển vector tái tổ hợp. Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt bằng NcoI/NotI nhận
được một băng duy nhất có kích thước như ước tính khoảng 3,3 kb dùng để phục vụ
phát triển vector (Hình 3.6B).
Gắn gen GmEXP1 vào vector mở vòng pRTRA7/3
Gen GmEXP1 mang đầu dính của cặp enzyme giới hạn NcoI/NotI được gắn vào vector pRTRA 7/3 mở vòng nhờ phản ứng gắn nối với sự xúc tác của DNA T4 ligase tạo ra cấu trúc tái tổ hợp pRTRA_GmEXP1. Vector tái tổ hợp được biến nạp bằng sốc nhiệt vào tế bào khả biến E.coliDH5α và chọn dòng qua phản ứng colony - PCR với cặp mồi đặc hiệu SoyExp1F_ NcoI/SoyExp1 R_NotI. Kết quả điện di kiểm tra (Hình 3.6C) cho thấy, cả 3 dòng khuẩn lạc xuất hiện một băng DNA đặc hiệu khoảng 0,79 kb tương ứng với kích thước của gen GmEXP1 (cùng xuất hiện ở làn điện di đối chứng dương). Như vậy, cả ba dòng vi khuẩn chọn lọc đều mang plasmid tái tổ hợp chứa gen GmEXP1. Plasmid tái tổ hợp pRTRA_GmEXP1 được sử dụng để thu nhận cấu trúc mang gen GmEXP1 phục vụ phát triển vector chuyển gen ở thực vật.