5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
3.5.2. Phân tích các cây đậu tương chuyển ge nở thế hệ T0
3.5.2.1.Xác định sự có mặt của gen chuyển GmEXP1 trong hệ gen cây đậu tương
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển GmEXP1 trong các đậu tương chuyển gen, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu SoyExp1F_NcoI/ SoyExp1R_NotI để khuếch đại gen cần xác định. Theo phân tích ở nội dung 3.2.1.3 của luận án, gen nội tại và gen chuyển GmEXP1 phân biệt nhau ở đặc điểm có và không có intron. Khi thực hiện PCR bằng cặp mồi đặc hiệu, gen GmEXP1 nội tại
cho phân đoạn DNA có kích thước 1513 bp, trong khi gen ngoại lai cho phân đoạn
DNA kích thước 790 bp.
Tiến hành tách chiết, tinh sạch DNA tổng số từ lá của 9 cây đậu tương chuyển gen và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Kết quả kiểm tra sản phẩm
PCR trên gel agarose 0,8% được thể hiện ở hình 3.22.
Hình 3.22. Kết quảđiện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển GmEXP1
trong các cây đậu tương chuyển gen
M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 9: sản phẩm PCR các cây chuyển gen; (+): sản phẩm PCR vector chuyển gen GmEXP1; (-): sản phẩm PCR DNA cây đậu tương không chuyển gen.
Trên gel điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen GmEXP1 (Hình 3.22), làn chạy điện di của cây số 4 và số 7 xuất hiện hai băng DNA với kích thước khoảng 1,51 kb và 0,79 kb tương ứng với kích thước ước tính cho gen GmEXP1 nội tại và gen
GmEXP1 ngoại lai. Hai băng DNA nói trên xuất hiện ngang với vị trí của băng DNA ở làn điện di cây đối chứng âm (không chuyển gen) và làn điện di đối chứng dương (sản phẩm PCR trực tiếp vector chuyển gen GmEXP1). Điều đó chỉ ra rằng, hệ gen của cây
đậu tương chuyển gen số 4 và số 7 (ký hiệu là DT04 và DT07) có mặt của gen ngoại lai
GmEXP1. Hiệu suất chuyển gen GmEXP1ởgiai đoạn đánh giá này đạt 2/380 = 0,53%.
Như vậy có thể thấy, vector chuyển gen pCB301_GmEXP1 đã thiết kế không chỉ phù hợp với cây thuốc lá mô hình mà còn có khả năng chuyển được gen đích
GmEXP1 vào cây đậu tương. Các cây đậu tương chuyển gen dương tính với phản
ứng PCR chính là kết quảban đầu có thể đưa đến thành công của quy trình chuyển gen GmEXP1vào cây đậu tương. Các cây dương tính với phản ứng PCR được chăm sóc và ưu tiên phát triển nhằm có những phân tích tiếp theo về khảnăng hoạt động và biểu hiện của gen chuyển GmEXP1.
3.5.2.2.Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 dựa trên sự có mặt của protein expansin ngoại lai trên cây đậu tương chuyển gen
Protein expansin ngoại lai xác định bởi gen chuyển GmEXP1 có đặc điểm phân biệt với protein expansin nội tại là có chứa đuôi c-myc ởphía đầu C của chuỗi polypeptide. Phản ứng lai western cho phép phát hiện những protein trên màng lai
nitrocellulose có mang đuôi c-myc khi gắn kháng thể phù hợp để cho phản ứng màu với cơ chất. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành chiết protein tổng số từ lá các cây
đậu tương chuyển gen dương tính với phản ứng PCR (DT04 và DT07) và tiến hành
điện di biến tính trên SDS-PAGE, chuyển lên màng lai nitrocellulose, blocking, laivới kháng thể c-myc (kháng thể 1), lai với kháng thể 2. Sử dụng protein tổng số
tách chiết từ lá cây thuốc lá chuyển gen T1 (trong đó có protein expansin tái tổ hợp)
làm đối chứng dương. Kết quả hiện màu với cơ chất DAB thể hiện ở hình 3.23.
Hình 3.23. Kết quả lai Western trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0
M: thang chuẩn protein 10-180 kDa; DT04, DT07: mẫu cây chuyển gen số 4 và 7; (-): mẫu cây đậu
tương không chuyển gen; (+): protein tổng số từ cây thuốc lá chuyển gen T130
Hình 3.23 cho thấy, trên màng lai nitrocellulose ở làn điện di protein cây đậu
tương DT04 xuất hiện một băng màu ở vị trí kích thước khoảng 30 kDa, tương ứng với kích thước băng màu xuất hiện ở làn đối chứng dương. Điều đó chứng tỏ rằng gen chuyển GmEXP1 ở cây đậu tương chuyển gen DT04 đã biểu hiện dịch mã cho protein expansin tái tổ hợp. Cây chuyển gen DT04 tiếp tục được chăm sóc, ưu tiên
Chương 4.THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Trong một vài năm trở lại đây, do biến đổi khí hậu mà trái đất ngày càng nóng
lên, hạn hán kéo dài xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới. Việt Nam là một trong những quốc gia bị tác động mạnh mẽ của sự biến đổi khí hậu, do đó hạn hán và hoang hoá
đang ngày một gia tăng. Đây là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng
suất và chất lượng cây trồng nông nghiệp cũng như thu hẹp diện tích đất canh tác.
Đối mặt với tình trạng trên, việc triển khai các nghiên cứu nhằm chọn tạo được các giống cây trồng nông nghiệp có khảnăng chống chịu được các điều kiện bất lợi của
môi trường đang là vấn đề cấp bách trong giai đoạn hiện nay.
Một trong những vấn đề quan trọng nằm trong chiến lược phát triển kinh tế
nông nghiệp của nhiều nước trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng là ổn
định và nâng cao năng suất, phẩm chất các giống cây trồng. Đặc biệt đối với nước ta có hệ sinh thái rất đa dạng, khí hậu giữa các vùng miền không giống nhau, do vậy
nghiên cứu sự thích ứng của cây trồng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi là một vấn
đề có tầm quan trọng quyết định sự phát triển của ngành trồng trọt. Trong các tác
động của ngoại cảnh thì nước là yếu tố quan trọng nhất đối với đời sống bình
thường của thực vật, vì vậy, bài toán thiếu nước do điều kiện khô hạn đang được
quan tâm đặc biệt và đòi hỏi cách tiếp cận khoa học để tìm lời giải cho hiện trạng này trong sản xuất nông nghiệp. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Do vậy, nghiên cứu đặc tính chịu hạn,
cơ sở sinh lý, hoá sinh và sinh học phân tử làm cơ sở cho việc cải thiện khả năng chống chịu hạn phục vụ chọn giống đậu tương vừa có năng suất, chất lượng và vừa
ưu việt về khảnăng chịu hạn mang tính thời sự và đang được quan tâm hàng đầu. Chọn tạo giống đậu tương chống chịu tốt với điều kiện khô hạn đã được tiến hành với các biện pháp như chọn lọc quần thể, lai giống truyền thống, tạo đột biến thực nghiệm đã thu được những thành quả nhất định, có thể kể đến như giống đậu
tương DT2008 do Viện Di truyền Nông nghiệp chọn tạo bằng phương pháp lai
giống DT2001 với HC100 (gốc Mexico) kết hợp phương pháp đột biến thực nghiệm có mức độ chống chịu khô hạn tương đương với đậu tương chịu hạn cao Williams
82 của thế giới [50]; dòng đậu tương ML48, ML61 có khảnăng chịu hạn cao do tác giả Chu Hoàng Mậu chọn tạo bằng cách sử dụng tia gammar kết hợp hoá chất NMU và IE gây tạo đột biến [12]. Tuy nhiên, các phương pháp chọn giống truyền thống tốn nhiều thời gian, hiệu quả chậm, phức tạp và cần thao tác trên quần thể với số lượng đủ lớn. Để khắc phục những khó khăn trên, gần đây với việc ứng dụng tiến bộcủa kỹ thuật chuyển gen ở thực vật đã tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen biểu hiện những đặc tính quan trọng, trong đó việc nâng cao khả năng chịu hạn cũng đã thu được những thành quảđáng kể. Trong các nghiên cứu của Zhang và cs (2010) [145], Li và cs (2013) [78], de Paiva Rolla và cs (2014) [40], de Ronde và cs (2004) [41], Valente và cs (2009) [127] và một số nhà nghiên cứu khác, các dòng
đậu tương biến đổi gen khi thử nghiệm đều cho kết quả chống chịu hạn tốt hơn và cho năng suất cao hơn so với đối chứng. Ở Việt Nam, trong vài năm gần đây các
dòng cây đậu tương chuyển gen đã được công bố bởi Trần Thị Cúc Hoà (2007) [7], Nguyễn Thị Thuý Hường (2011) [9], Nguyễn Thu Hiền (2014) [6], Lò Thị Mai Thu
(2014) [18], trong đó tác giả Nguyễn Thị Thuý Hường đã thành công tạo được cây
đậu tương chuyển gen P5CS theo định hướng chọn giống đậu tương chịu hạn.
Về mặt cơ sở di truyền học, đặc tính chịu hạn là tính trạng được xác định bởi nhiều gen. Các gen liên quan đến đặc tính chịu hạn phân thành hai nhóm, đó là: (1)
nhóm gen mã hoá protein chức năng (xác định enzyme tham gia vào một khâu nào
đó trong chuỗi phản ứng liên quan đến đặc tính chịu hạn, xác định các protein kênh màng, chất môi giới phân tử, enzyme khử độc tố, chất chống oxy hoá...) và (2) nhóm gen mã hoá protein điều hoà (là các nhân tố điều chỉnh hoạt động các gen
khác như NAC, MYB, DREB...). Cho tới nay đã có nhiều nghiên cứu vềđặc điểm, chức năng và cơ chế phân tử cũng như thử nghiệm vai trò các gen thuộc hai nhóm
gen trên ở cây mô hình. Từ đó hướng đến ứng dụng cải thiện đặc tính chịu hạn ở
cây trồng trong đó có đậu tương. Tuy nhiên, việc chuyển các gen thuộc hai nhóm trên nhằm cải thiện đặc tính chịu hạn có thể gặp một số khó khăn về biểu hiện gen
chuyển ởcơ thể chuyển gen dẫn đến hiệu quảđạt được không như mong muốn. Sản phẩm gen ngoại lai là protein điều hoà có thểvướng phải những vấn đề như: (i) đa
sốprotein điều hoà hoạt động theo kiểu cis-trans đòi hỏi phải có sự cân bằng tương
bởi chính sản phẩm của nó tạo ra; (iii) khó có thể kiểm soát được sự kích hoạt gen
đích. Sản phẩm gen ngoại lai là protein chức năng thường là enzyme xúc tác cho một khâu của chuỗi phản ứng thì đòi hỏi sự cân bằng về cơ chất và hoạt động xúc tác của enzyme ở các khâu kế cận. Vì vậy, xác định được gen giữ vai trò then chốt
(gen chìa khoá) trong chuỗi phản ứng hình thành đặc tính chống chịu hạn của thực vật là bài toán còn nhiều ẩn sốđối với sinh học phân tửvà kỹ thuật di truyền.
Môi trường cực đoan như hạn hán, ngập mặn, ngập úng, nhiệt độ cao thường làm mất cân bằng về áp suất thẩm thấu gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của nhiều loại cây trồng [81]. Hai phản ứng thường gặp khi thực vật gặp các điều kiện bất lợi về nước là tăng tốc độ tổng hợp, tích luỹ các chất chuyển
hoá để tăng cường áp suất thẩm thấu cho tếbào và sự phát triển bộ rễđể có thể thu nhận được nhiều nước. Trong điều kiện thiếu nước, bộ rễ phát triển mạnh mẽhơn so
với cây được cung cấp nước đầy đủ. Sự phát triển bộ rễ còn được coi là tiêu chí quan trọng đểđánh giá khả năng chống chịu hạn của thực vật. Khi so sánh các chỉ
tiêu về chiều dài rễ chính, thể tích và khối lượng khô bộ rễ của các giống đậu tương
nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy giống SL1 ưu thế hơn các giống còn lại về các chỉ
tiêu nói trên. Dựa trên cơ sở đó, SL1 được lựa chọn để cung cấp gen phục vụ phát triển vector chuyển gen nhằm cải thiện khả năng chịu hạn theo hướng cải tiến bộ rễ
nhờ kỹ thuật chuyển gen.
Cơ sở phân tử điều khiển sự phát triển bộ rễ đậu tương đã được Delis và cs (2005) [42], Hoon Ahn và cs (1998) [56], Quach và cs (2014) [102], Sun và cs (2014) [115] và một số tác giả khác quan tâm nghiên cứu ở mức độ phân lập, và đánh giá
một số gen liên quan trên cây mô hình. Nghiên cứu của Lee và cs (2003) cho thấy
gen GmEXP1thuộc họ gen expansin xác định protein giữ vai trò chủđạo trong việc kéo giãn thành tế bào và chỉ hoạt động ở mô vùng sinh trưởng chóp rễ có chức năng
phát triển kéo dài rễ cây đậu tương [72]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, gen
GmEXP1 được phân lập từ giống đậu tương SL1 (giống có bộ rễ phát triển tốt) có
kích thước 768 bp và xác định protein expansin gồm 255 amino acid, tương đồng với gen GmEXP1 mà Lee đã công bố. Protein expansin len lỏi trong vách tế bào, bẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa các polysaccharid, nới lỏng mạng lưới vi sợi cellulose dẫn tới lớp thành tế bào vững chắc dễdàng được kéo giãn dưới áp lực sức trương tế bào
[32]. Có thể thấy expansin là dạng protein chức năng, hoạt động độc lập không nằm trong các khâu khác nhau của một chuỗi phản ứng; không bị giới hạn bởi lượng cơ
chất trong tếbào cơ thể. Vì vậy lựa chọn chuyển gen GmEXP1 nhằm tăng hàm lượng
sản phẩm protein expansin cho tếbào để cải tiến sự phát triển bộ rễđậu tương có thể tránh được những khó khăn trong biểu hiện tính trạng của gen ngoại lai và có thể dễ đạt được hiệu quả mong muốn. Tiếp tục nghiên cứu làm rõ cơ chế phân tử của gen
GmEXP1 điều khiển sự phát triển bộ rễ đậu tương chống lại điều kiện khô hạn từ ngoại cảnh, từđó đề xuất hướng cải thiện khảnăng chịu hạn ở thực vật theo cách tiếp cận cải tiến bộ rễ là hướng nghiên cứu quan trọng, thời sự và cần thiết.
Quá trình thiết kế vector chuyển gen thực vật, ngoài việc phải bảo đảm yêu cầu tối thiểu của một vector cần chú ý đến một số khía cạnh quan trọng như: các
thành phần cần thiết cho hoạt động của gen ngoại lai trong tế bào chủ, gen đi kèm gen đích giữ vai trò làm chỉ thị cho chọn lọc thể tái tổ hợp, khả năng khởi động phiên mã của gen đích trong tế bào chủ. Gen đích đưa vào tế bào chủ, ngoài trình tự
mã hoá ra cần phải có những yếu tố cần thiết giúp gen hoạt động như một đơn vị
chức năng độc lập trọn vẹn, như: yếu tố khởi đầu và kết thúc phiên mã, yếu tố xác
định vị trí hướng đích cho sản phẩm hoạt động của gen chuyển. Vai trò khởi động phiên mã gen đích thuộc về promoter. Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, người
ta thường sử dụng một số loại promoter như 35S, act, mas,... Trong đó 35S là một promoter mạnh được phân lập từ virus gây bệnh khảm lá súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus - CaMV). Promoter mạnh này có thể khởi động phiên mã cho gen trong tất cả các loại mô bào thực vật ở tất cảcác giai đoạn sinh trưởng và phát triển. Trong nghiên cứu này, khi phát triển vector chuyển gen pCB301, chúng tôi sử dụng promoter CaMV35S đưa vào đoạn cấu trúc chứa gen chuyển. Lựa chọn CaMV35S
cho vector chuyển gen nhằm hướng đến việc khởi động gen GmEXP1, tăng cường sinh tổng hợp protein expansin, từ đó cải tiến bộ rễ cây đậu tương ngay trong điều kiện bình thường để phòng ngừa khô hạn. Một khía cạnh khác cần quan tâm là vai trò của những thành phần trong cấu trúc làm chỉ thị cho chọn lọc. Trong chuyển gen thực vật, giai đoạn chọn lọc nguyên liệu ngay sau biến nạp thường sử dụng kháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ là nhờ hoạt tính kháng của sản phẩm gen đính kèm. Gen đính kèm thường sử dụng vào vector chuyển gen như: nptII - kháng kanamycin, hpt
biến nạp dựa vào sự có mặt của protein ngoại lai được xem là tín hiệu hiệu quả cho chọn tạo cây chuyển gen. Kỹ thuật Western blot cho phép phát hiện và lựa chọn thể
chuyển gen có biểu hiện protein đích, thậm chí có thể định lượng được protein ngoại lai nếu áp dụng kỹ thuật ELISA. Hai kỹ thuật nói trên đều dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu và ngưng kết giữa kháng thể với kháng nguyên là protein đính
kèm với protein ngoại lai. Có nhiều cặp kháng nguyên - kháng thểđược xây dựng
để sử dụng cho mục đích chọn tạo thực vật chuyển gen, tuy nhiên việc gắn đuôi c- myc là một lựa chọn tốt và phù hợp vì tính hiệu quả, phổ biến và kinh tế cho nhiều nghiên cứu hiện nay [19]. Tập hợp các thành phần nói trên nằm giữa bờ trái (Left Border) và bờ phải (Righ Border) của vector thiết kế bảo đảm cho gen đích hoạt
động và dễ dàng lựa chọn, sàng lọc thể tái tổ hợp được gọi là cấu trúc gen chuyển