* Nhiệt độ thích hợp
XK được nuôi trên môi trường Gause 1 trong khoảng nhiệt độ từ 200
C – 450C. Quan sát sự sinh trưởng của XK sau 7 -14 ngày. Quan sát sự sinh trưởng của XK sau 7 -14 ngày.
2.3.5. Phương pháp xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA
2.3.5.1. Tách DNA tổng số
- B1. Thu sinh khối bằng cách ly tâm 6000 vòng trong 10 phút. Lặp lại nhiều lần để thu đủ mẫu
- B2. Bổ sung 200 µl TE 10Nm, pH 8, vortex kỹ
- B4. Ly tâm 12000 vòng/10 phút/40C
- B5. Hút dịch phía trên sang eppendorf mới, xác tế bào tiếp tục được xử lý. - B6. Eppendorf chứa xác tế bào cho vào lò vi sóng ở mức low level trong 130 giây, lặp lại 3 lần
- B7. Trộn đều xác tế bào với dịch đã hút trước đó
- B8. Bổ sung 500 µl CI (chloroform: isomyl alcotrol tỷ lệ 24:1), đảo đều, ly tâm 12000 vòng/10 phút/40
C. Hút pha trên chuyển sang epp mới
- B9. Tủa bằng 400 µl isopropanol (tỷ lệ thể tích 1:1), giữ ở -200C trong 2-3 giờ.
- B10. Ly tâm 12000 vòng/15 phút/ 40C. Đổ dịch rửa tủa bằng cồn 700 C (400 µl), rồi ly tâm 12000 vòng/ 7 phút/ 40 C.
- B11. Làm khô mẫu bằng máy hút chân không. DNA thu được hòa tan trong 20 µl dH2O.
2.3.5.2. Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR
Trình tự cặp mồi được sử dụng để nhân đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số cho chủng TT1.2 là.
341F : 5’- CCT ACG GGA GGC AGC AG -3’ 907R : 5’- CCG TCA ATT CCT TRA GTT T -3’
Thành phần phản ứng: Buffer Taq (10X): 2,5 µl; dNTPs (2,5 mM): 2,5 µl; MgCl2 (25 mM): 3 µl; Mồi xuôi (20 µM): 1 µl; Mồi ngược (20 µM): 1 µl; DNA khuôn: 1 µl; Taq DNA polymerase (5 U/µl): 0,3 µl; Nước khử ion: 13,7 µl; Tổng thể tích: 25µl.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR được sử dụng để nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng TT1.2
Bảng 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tác dụng
1 940C 5 phút 1 Biến tính 2 940C 550C 720C 1 phút 50 giây 1 phút 32 Biến tính Gắn mồi Tổng hợp chuỗi 3 720C 7 phút 1 Tổng hợp chuỗi
4 40C ∞ Bảo quản mẫu
Sản phẩm PCR được tinh sạch theo quy trình hướng dẫn của bộ kit AccuPrep PCR Purrification Kit (hãng Bioneer). Cụ thể:
- Bước 1: Bổ sung 5 lần thể tích của sản phẩm PCR bằng buffer 1 (PCR - Binding Buffer). Hòa tan cho tới khi tan hoàn toàn.
- Bước 2: Chuyển hỗn hợp sang eppendorf chứa cột DNA binding và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
- Bước 3: Bỏ dịch và bổ sung 500µl Buffer 2 vào eppendorf chứa cột DNA binding và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
- Bước 4: Bỏ dịch và lặp lại bước 3.
- Bước 5: Làm khô cột chứa DNA binding bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
- Bước 6: Bổ sung Buffer 3 vào giữa cột và đợi 1 phút tại nhiệt độ phòng. - Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột, thu dịch. Bảo quản mẫu ở 4o
C.
2.3.5 16S rRNA
Sản phẩm PCR sau khi đã được tinh sạch được gửi xác định trên máy đọc tự động ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v.1.0 được sử dụng bộ kit BigDye Terminator V3.0 Cycle Sequencing. Trình tự gen thu được được
xử lý bằng phần mềm BioEdit và DNA star.
2.3.6. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh tổng hợp chất kháng sinh
* Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Chủng XK TT1.2 lựa chọn, được lên men trên môi trường thích hợp nuôi trong bình nón dung tích 250ml chứa 25ml môi trường với thành phần môi trường có thay thế và bổ sung tinh bột tan bằng các nguồn cacbon (1%): Glucose, lactose, saccarose, tinh bột tan, glyxerin.
Bổ sung giống và lên men trên máy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28 – 300C. Sau 168 giờ lên men xác định HTKS trong dịch lên men bằng phương pháp lỗ thạch.
Sau khi xác định được nguồn cacbon thích hợp nhất, để tối ưu nồng độ nguồn cacbon, Chủng XK TT1.2 được nuôi cấy trong môi trường có nguồn cacbon thích hợp với các nồng độ khác nhau từ 0,5 – 3,5%, cách nhau 0,5%.
* Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Chủng XK TT1.2 được lên men trên môi trường dịch thể trong bình nón dung tích 250ml chứa 25ml môi trường với thành phần môi trường có thay thế và bổ sung KNO3 bằng các nguồn nitơ (0,5%): peptone, NaNO3, KNO3, (NH4)2SO4, cao thịt, bột đậu tương, cao nấm men.
Bổ sung giống và lên men trên máy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28 – 300C. Sau 168 giờ lên men xác định HTKS trong dịch lên men bằng phương pháp lỗ thạch.
Sau khi xác định được nguồn nitơ thích hợp nhất, để tối ưu nồng độ nguồn nitơ, chủng XK TT1.2 được nuôi cấy trong môi trường có nguồn nitơ thích hợp với các nồng độ khác nhau từ 0,5 - 3%, cách nhau 0,5%.
* Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu, chủng XK TT1.2 được nuôi cấy trên môi trường (thích hợp) dịch thể có bổ sung nguồn cacbon và nguồn nitơ thích hợp nhất, nuôi lắc 220 vòng/phút ở các nhiệt độ 250