2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU *Xạ khuẩn *Xạ khuẩn
Gồm có 74 chủng xạ khuẩn phân lập từ 103 mẫu đất thu được từ những địa điểm khác nhau của tỉnh Thái Nguyên và các tỉnh lân cận được sử dụng và tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính kháng sinh.
*Vi sinh vật kiểm định
Gồm 9 chủng VSV kiểm định, trong đó có 7 chủng vi khuẩn thuộc 2 nhóm vi khuẩn G (+) và vi khuẩn G (-) và 2 chủng nấm mốc (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các chủng vi sinh vật kiểm định
Vi sinh vật kiểm định Cơ quan cung cấp
VK G (+)
Staphylococcus aureus ATCC
25923 Viện Kiểm Nghiệm – Bộ Y tế
Bacillus subtilis VTCC-B-888 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam
Micrococcus leteus VTCC - B-
644 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam
VK G (-)
Escherichia coli VTCC-B-883 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam
Pseudomonas aeruginosa VTCC-
B-481 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam
Shigella flexneri VTCC - B- 479 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam
Salmonella entericatyphi VTCC -
B- 480 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam
Nấm mốc
Fusarium oxysporum VTCC-F-
1301 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BI VÀ MÔI TRƢỜNG
2.2.1. Hóa chất
- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3, NaCl, FeSO4.7H2O, NaNO3
- Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, peptone… của hãng Merck (Đức). - Các loại hóa chất khác: Thạch, tinh bột tan, saccharose, của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy đo pH 151 Martini (Nhật) - Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức) - Máy cất nước Hamilton
- Nồi khử trùng (Đài Loan) - Tủ lạnh –200C - Cân phân tích, cân kỹ thuật - Tủ lạnh 40C - Lò vi sóng Sharp
- Các dụng cụ thủy tinh như: que chang, ống nghiệm, que cấy, đĩa petri, bình tam giác, cốc đong...do Việt Nam, Trung Quốc, Đức sản xuất
2.2.3. Môi trường nghiên cứu
* Môi trường Gause I (g/l): Tinh bột tan: 20; K2HPO4: 0,5; MgSO4.7H2O: 0,5; NaCl: 0,5; KNO3: 0,5; FeSO4: 0,01; Thạch: 20; Nước máy vừa đủ 1 lít, pH: 7,0 - 7,4.
* Môi trường Gause 2(g/l): Cao thit 3, pepton 5, Glucose 10, NaCl 5, nước máy vừa đủ 1 lít,
pH= 7,0- 7,2.
* Môi trường MPA (g/l): Cao thịt: 5; pepton: 10; NaCl: 5; thạch: 18; Nước máy vừa đủ 1 lít; pH: 7,0 - 7,2.
* Môi trường FNA (g/l): Cao thịt: 3g/l; pep ton: 5g/l; thạch: 16g/l; Nước máy vừa đủ 1 lít.
* Môi trường Czapek - Thom (g/l): NaNO3: 2; K2HPO4: 1; MgSO4: 0,5; KCL: 0,5; FeSO4: 0,01; Saccharose: 30; Thạch: 20; Nước máy vừa đủ 1 lít; pH = 7 - 7,4
* Môi trường ISP1 (g/l): Tripton 5, Cao nấm men 1, Thạch 18, Nước máy vừa đủ 1 lít, pH= 7,0-7,2
* Môi trường ISP6 (g/l): Pepton: 6, Xitrat sắt: 0,5, Cao nấm men: 1, Thạch: 20, Nước cất vừa đủ 1 lít, pH= 7,0-7,2
* Môi trường 79 (g/l): Glucose: 10, Pepton: 10, Cao nấm men:2. Casein thủy phân: 2, NaCl: 6, K2HPO4: 0.2, Thạch: 20, Nước cất vừa đủ 1 lít, pH=7,0-7,4.
* Môi trường hữu cơ-Agar (g/l): Cao thịt: 30, Pepton: 5, Glucose: 10, Thạch: 20, Nước cất vừa đủ 1 lít, pH: 7,0-7,2
* Glycerin-Nitrat (g/l): Glycerin: 30, NaNO2: 2, KH2PO4: 1, FeSO4.7H2O: 0,01, MgSO4: 0.5, Thạch: 20, pH: 7,0-7,2, Nước cất vừa đủ 1 lít.
* Môi trường ISP4: Tinh bột:10, K2HPO4: 1, (NH4)2SO4: 2, MgSO4.7H2O: 1,CaCO3:2, NaCl: 1, Dung dịch muối vệt: 1ml, pH = 7,0 ÷ 7,4 Nước cất vừa đủ 0,5 lít.
- Dung dịch muối vệt: FeSO4.7H2O:0,1, ZnSO4.7H2O:0,1, MnCl2.4H2O: 0,1, Nước cất vừa đủ 0,1 lít.
* Môi trường A – 4: Glucose: 10, CaCO3: 1, Bột đậu tương: 10, NaCl: 5, pH = 7, Nước máy vừa đủ 1 lít.
* Môi trường A – 4H: Glucose: 15, CaCO3: 1, Bột đậu tương: 15, NaCl:5,pH = 7, Nước máy vừa đủ 1 lít.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU , , 10-2,10-3 ……10 -6 10-3 10 -6 100 300 – – - .
2.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh
* Phương pháp thỏi thạch (dùng để sơ tuyển xạ khuẩn)
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause - I trong đĩa petri sau 7 ngày dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào đĩa petri đã cấy VSV kiểm định. Sau đó để vào tủ lạnh 4 – 6 giờ cho CKS khuếch tán vào thạch rồi để vào tủ ấm nuôi ở 280
C – 300C, đọc kết quả sau 3 – 5 ngày. HTKS được xác định dựa vào kích thước vòng vô khuẩn (D - d, mm), D là kích thước vòng vô khuẩn và d là đường kính thỏi thạch [4], [5].
* Phương pháp đục lỗ thạch (Xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch thể) Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV kiểm định trong đĩa petri. Nhỏ vào các lỗ khoan dung dịch cần thử (các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp thỏi thạch).
2.3.3. Phương pháp xác định sinh khối vi sinh vật
Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov sinh khối được xác định dựa vào trọng lượng khô tuyệt đối. Lấy 100ml dịch lên men lọc qua giấy lọc
sấy khô đến trọng lượng không đổi, rửa sạch hệ sợi xạ khuẩn lần lượt bằng dung dịch HCl 1N và nước cất. Sấy khô ở 80 – 1000C tới trọng lượng không đổi. Sinh khối được tính bằng sự chênh lệch giữa trọng lượng tờ giấy lọc có sinh khối và trọng lượng tờ giấy lọc khô đã cân trước đó.
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
2.3.4.1. Đặc điểm hình thái
* Quan sát cuống sinh bào tử
Cấy ria XK trên môi trường Gause 1, sau đó cắm lamen nghiêng 450 trên bề mặt môi trường. Sau 5-7 ngày nuôi ở nhiệt đọ phòng, lấy lamen đem quan sát hình dạng CSBT dưới kính hiển vi quang học và chụp ảnh.
CSBT có thể có ở 3 dạng: RF (rectiflexibiles): dạng thẳng và dạng lượn sóng: RA(retinaculiaperti): dạng xoắn, thô sơ và ngắn; S (spirales): CSBT dạng xoắn và ngắn.
* Quan sát bề mặt bào tử
Dùng que cấy lấy một ít KTKS có bào tử, sau đó cố định mẫu bằng glutaraldehyde 3% rửa bằng mẫu dung dịch đệm cacodylate và cố định lại bằng axit osmic 1% (OsO4 1%). Tiếp tục rửa lại bằng đệm cacodylate 1% và khử nước bằng cồn có nồng độ tăng dần từ 30 – 100 độ. Cho mẫu lên đế đẻ kho tự nhiện. Sau đó tiến hành mạ phủ vàng bằng máy JFC 1200. Soi và chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử quét JSM 5410LV tại viện 69, Bộ tư lệnh lăng, Hà Nội.
Bào tử có các dạng: tròn, elip, que, ovan... Bề mặt bào tử có thể gặp các dạng: Sm (Smooth): dạng nhẵn, Wa (Warty): dạng mụn cóc; Sp (Spiny): dạng gai; Ha (Hairy): dạng tóc; Ru: dạng nếp nhăn.
2.3.4.2. Đặc điểm nuôi cấy
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường Gause 1, Gause 2, ISP 1, ISP 4, ISP 6, môi trường 79, môi trường hữu cơ - aga, môi trường glycerin- nitrat ở nhiệt độ phòng. Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát màu sắc KTKS, KTCC và sắc tố tiết ra môi trường theo phương pháp của Shirling và Gottlieb [34], [43].
2.3.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa * Khả năng đồng hóa nguồn đường
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP 9 có bổ sung 1% nguồn đường khác nhau: D – glucose, Saccharose, Fructose, Lactose, Manitol, Inosotol, Xylose, Raffinose...
Cách làm; Cân 1g đường, thanh trùng bằng đèn UV rồi bổ sung 100ml môi trường ISP 9 còn nòng, lắc đều rồi đỏ vào ống nghiệm và nuôi cấy XK ở nhiệt độ 30 0
C. Sau 7-14 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng và so sánh với đối chứng. Trong đó môi trường không có đường được gọi là đối chứng âm.
* Khả năng chịu muối
Nuôi cấy XK trên môi trường ISP 1 có bổ sung thêm NaCl với các nồng