2.3.7.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy
Một trong những vector tạo dòng nhân tạo thuộc thế hệ mới nhất và được sử dụng phổ biến hiện nay là vector pGEM-T Easy [44]
940C, 2’ 520C, 1’ 72 0C, 1’ 720C, 10’ 40C, ∞ 30 chu kỳ 940C, 1’
Vector PGEM – T Easy [44] Phƣơng pháp tiến hành:
- Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối T4- ligase. Phản ứng nối ghép được tiến hành với tổng thể tích là 10µl.
- Quá trình nối ghép được tiến hành ở 40C trong 14-16 giờ
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
10x ligation buffer 5µl
pGEM-T Easy 1µl
Sản phẩm PCR (10ng) 3µl
T4 DNA ligase 1µl
2.3.7.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α
Nguyên tắc
Dưới tác dụng của CaCl2 thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở lên xốp tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt [33].
Quy trình gồm 2 bƣớc:
* Tạo tế bào khả biến bằng muối CaCl2
- Cấy chuyển một khuẩn lạc E. coli DH5α vào 5ml môi trường LB, lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 370C qua đêm.
- Cấy chuyển 3ml dịch tế bào nuôi cấy qua đêm vào 30 ml môi trường LB, nuôi lắc trong 1,5 giờ để OD600 đạt 0,4-0,6, sau đó đặt trên đá trong 1 giờ. Tất cả các bước tiếp theo đều tiến hành ở 40
C.
- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn. Cặn ly tâm được hòa tan trong 1 ml dung dịch muối CaCl2 100mM lạnh, vô trùng rồi đem ủ trên đá khoảng 15 phút.
- Tiếp tục ly tâm ở cùng điều kiện, thu cặn và hòa tan bằng dung dịch CaCl2 100mM, sau đó ủ đá trong 1h.
- Ly tâm thu tế bào ở 4000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó bổ sung 1 ml CaCl2 100mM lạnh, vô trùng có chứa 15% glyxerol. Chia vào mỗi ống eppendorf 100 μl tế bào và giữ tế bào ở -800C để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
* Biến nạp:
- Tế bào khả biến lấy ra từ tủ -800C được làm tan từ từ trên đá.
- Bổ sung 5μl vector tái tổ hợp vào 100μl tế bào khả biến, đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều, tiếp tục ủ đá 30 phút.
- Sốc nhiệt: Mẫu đang đặt trong đá được để ngay vào bể ổn nhiệt có nhiệt độ 420C trong 1 phút. Sau đó mẫu lại được lấy ra và đặt nhanh lên đá trong 2 phút.
- Bổ sung 200μl môi trường LB và lắc 200 vòng/phút trong 1-1,5 giờ ở 370C. - Sử dụng 100μl dịch cấy trải trên 1 đĩa môi trường LBA có bổ sung kháng sinh Ampiciline 50 g/ml + Xgal 80 g/ml, nuôi qua đêm ở 370C .
2.3.7.3. Sàng lọc khuẩn lạc bằng kỹ thuật colony - PCR với mồi M13
- Các thành phần phản ứng colony - PCR tương tự như phản ứng khuếch đại gen cry1C với mồi đặc hiệu, chỉ khác ở chỗ DNA template được thay thế bằng một lượng nhỏ sinh khối từ các khuẩn lạc trắng và sử dụng cặp mồi M13.
- Chu trình nhiệt:
940C: 5’ 550C: 1’30s 720C: 7’ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
940C: 1’ 720C:1’ 40C: ∞
2.3.7.4. Tách plasmid của vi khuẩn E. coli DH5α
Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli DH5α được nuôi lắc trong môi trường LB có bổ sung kháng sinh Amp 50μg/ml, ở nhiệt độ 370C trong 12 – 14h.
Các bước tách DNA plasmid sau đó tiến hành tương tự như với vi khuẩn Bt. 2.3.7.5. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzyme giới hạn
Vùng mcs của vector pGEM – T Easy có chứa trình tự cắt của enzyme EcoRI, vì thế có thể sử dụng enzyme này kiểm tra các vector đã được biến nạp vào tế bào
E. coli DH5α có mang đoạn gen đang nghiên cứu hay không [33,12]. Phản ứng cắt được thực hiện trong 4 giờ.
Trình tự cắt của enzyme EcoRI 5’……….GAATTC…………3’
3’………..CTTAAG…………..5’ Thành phần của phản ứng cắt: Thành phần Thể tích (µl) DNA plasmide 6µl Buffer 1µl EcoRI 0,5µl dH2O 2.5µl Tổng thể tích 10µl