có hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 3.1.1. Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành hoạt hóa 150 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus
chưa qua phân loại trên môi trường MPA. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 280C, trên đĩa thạch mọc lên các khuẩn lạc có hình thái giống khuẩn lạc nhóm Bacillus cereus. Đó là những khuẩn lạc tròn, có màu trắng sữa, mép khuẩn lạc có thể có răng cưa (hình 3.1).
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trƣờng MPA sau 72 giờ nuôi cấy ở 280C
Từ mỗi đĩa nuôi cấy chúng tôi tách lấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ làm tiêu bản với thuốc nhuộm fucshin base sau đó quan sát trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100X (vật kính dầu). Kết quả cho thấy, trong số 150 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus đã thu thập, có 54 chủng Bacillus thuringiensis sinh tinh thể. Kết quả phân loại hình dạng tinh thể được thể hiện trong hình 3.2, bảng 3.1
Bảng 3.1. Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu
STT Hình dạng Số chủng Tỷ lệ % 1 Lưỡng tháp 21 39 2 Cầu 4 7 3 Lưỡng tháp và cầu 26 48 4 Lập phương 1 2 5 Cầu và lập phương 1 2 6 Không xác định 1 2 Tổng số 54 100
Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của chủng TN1.12 và TN 36.3 phóng đại 100X dƣới kính hiển vi quang học (vật kính dầu)
Số liệu thống kê ở bảng 3.1 cho thấy, tinh thể của 54 chủng Bacillus thuringiensis
có 4 dạng chính: lưỡng tháp, cầu, lập phương và một số dạng không xác định. Trong 54 chủng sinh tinh thể, chiếm tỷ lệ cao nhất (48%) là các chủng sinh tinh 2 loại tinh thể hình lưỡng tháp và cầu. Tiếp đó là các chủng sinh 1 loại tinh thể hình lưỡng tháp (39%). Các chủng sinh tinh thể hình cầu, lập phương và đồng thời 2 loại tinh thể này chiếm tỷ lệ tương đối thấp, từ 2% đến 7%.
Qua kết quả trên có thể thấy các chủng Bt phân lập từ đất Thái Nguyên có độ đa dạng cao về dạng tinh thể. Sự khác nhau về cấu trúc cũng như hình dạng tinh thể là do thành phần protein cấu tạo tinh thể tạo nên. Sự phong phú về dạng tinh thể có thể dẫn tới sự đa dạng về độc tố Cry, là cơ sở tạo nên phổ diệt côn trùng rộng cho các chủng Bt nghiên cứu.
Theo nhiều công bố, dưới loài Bta chủ yếu sinh tổng hợp 2 loại tinh thể có dạng cầu và lưỡng tháp. Vì thế trong số các chủng sinh tinh thể, chúng tôi quan tâm tới các chủng sinh 2 loại tinh thể cầu và lưỡng tháp. Chúng có khả năng là các chủng thuộc dưới loài Bta cần tuyển chọn.
3.1.2. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis được chia thành nhiều dưới loài khác nhau. Các dưới loài được phân loại nhờ phản ứng ngưng kết với typ huyết thanh đặc trưng của chúng. Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai thuộc typ huyết thanh H7.
Để sàng lọc các chủng Bt thuộc dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai từ 26 chủng Bt sinh tinh thể cầu và lưỡng tháp, chúng tôi sử dụng phương pháp huyết thanh học đã mô tả trong mục 2.2.1 với bộ 56 huyết thanh do phòng Di truyền Vi sinh cung cấp. Các chủng Bt thuộc dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai sẽ có phản ứng ngưng kết với typ huyết thanh H7 . Kết quả phân loại dưới loài được thể hiện ở hình 3.3 và bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả phân loại dƣới loài của các chủng Bt sinh tinh thể
STT Dưới loài Bacillus
thuringiensis Typ huyết thanh Số chủng ngưng kết Tỷ lệ (%) 1 toguchini 31 1 3,84 2 aizawai 7 10 38,46 3 tochigiensis 19 2 7,69 4 asturiensis 53 1 3,85 5 thuringensis 1 5 19,23 6 sotto 4 1 3,85 7 tolworthi 9 1 3,85 8 canadensis 5 2 7,69 9 kim 52 2 7,69 10 Không ngưng kết 1 3,85 Tổng 9 26 100 Hình 3.3. Hình ảnh ngƣng kết của chủng 4J4 (A) và TN 6.12 (B) với typ huyết thanh H7 dƣới kính hiển vi quang học
Kết quả phân loại cho thấy có 25/26 chủng có phản ứng ngưng kết với 56 loại huyết thanh được dùng để thử. Các chủng ngưng kết thuộc về 9 dưới loài khác nhau. Trong tổng số 9 dưới loài đã được phân loại, có 2 dưới loài chiếm ưu thế, trong đó dưới loài aizawai chiếm tới 38,46%, xếp thứ hai là dưới loài thuringiensis
chiếm 19,23%, các dưới loài còn lại chiếm tỷ lệ từ 3,84% đến 7,69%. Ngoài ra, trong tổng số 26 chủng có 1 chủng không ngưng kết với bất kỳ typ huyết thanh nào. Đây có thể là các chủng thuộc các dưới loài khác hoặc dưới loài mới chưa được phát hiện.
Các chủng Bt được phân loại sẽ được bổ sung vào tập đoàn chủng giống Bt của phòng Di truyền Vi sinh vật, 10 chủng Bta đã phân loại được bằng phương pháp huyết thanh học kể trên, chúng tôi sử dụng cho các bước sàng lọc tiếp theo.
3.1.3. Thử hoạt tính của các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai trên sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)
Chúng tôi tiến hành thử hoạt tính diệt côn trùng bộ Cánh vảy của các chủng
Bta đã phân loại được nhằm chọn ra những chủng có hoạt tính diệt sâu cao. Côn trùng thử nghiệm là sâu xanh da láng và sâu tơ là 2 loại sâu phá hoại nghiêm trọng nhiều loại cây nông ngiệp.
3.1.3.1. Xác định nồng độ bào tử
Vi khuẩn Bt trong giai đoạn tạo bào tử sẽ đồng thời sinh tổng hợp các tinh thể độc. Thông qua nồng độ bào tử có thể gián tiếp ước lượng nồng độ tinh thể của các chủng nghiên cứu. Do đó chúng tôi tiến hành xác định nồng độ bào tử của các chủng Bta nghiên cứu cùng với chủng Bta chuẩn làm đối chứng dương. Phương pháp xác định nồng độ bào tử của các chủng Bta được trình bày ở mục 2.3.3.
Nồng độ bào tử của các chủng thử dao động từ 2,5.109 đến 5.109
bào tử/ml. Chúng tôi đã chọn ra 7 chủng Bta có nồng độ bào tử cao để tiến hành thử hoạt tính với côn trùng thử nghiệm, đó là các chủng: TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN5.3, TN 6.12, TN 28.6 và TN 36.3
Sinh khối của 7 chủng Bta được pha loãng nhiều lần, chúng tôi sử dụng nồng độ nồng 105 bào tử/ml và 107 bào tử/ml để thử hoạt tính với sâu tơ và nồng độ 107
3.1.3.2. Kết quả thử hoạt tính của các chủng Bta đối với sâu tơ và sâu xanh da láng
* Kết quả thử hoạt tính trên sâu tơ (Plutella xylostella)
Với 7 chủng Bta đã lựa chọn, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên đối tượng sâu tơ, tỷ lệ sâu chết được theo dõi trong 3 ngày và tính toán theo công thức Abbott. Kết quả thử nghiệm được trình bày trong hình 3.4 và bảng 3.3.
Hình 3.4. Thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta
sau 3 ngày thử nghiệm.
STT Tên chủng Tỷ lệ sâu chết (%) Nồng độ 105 bào tử/ml Nồng độ 10 7 bào tử/ml 1 ĐC âm 0 0 2 ĐC dương (4J4) 76,67 93,33 3 TN 1.12 53,33 80,00 4 TN 3.4 63,33 83,33 5 TN 4.4 50,00 76,67 6 TN 5.3 53,33 80,00 7 TN 6.12 56,67 80,00 8 TN 28.6 60,00 86,67 9 TN 36.3 53,33 83,33
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy 7 chủng Bta đem thử nghiệm đều có hoạt tính diệt sâu tơ tương đối cao. Sau 3 ngày thử hoạt tính đa số các chủng đều cho tỷ lệ sâu chết lớn hơn 50%, ở cả hai nồng độ pha loãng . Một số chủng như chủng TN28.6, TN36.3 và TN3.4., khi thử ở nồng độ 107 bào tử/ml có tỷ lệ sâu chết cao hơn hơn 80%.
* Kết quả thử hoạt tính trên sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)
Chúng tôi tiếp tục tiến hành thử hoạt tính của các chủng Bta nghiên cứu trên đối tượng sâu xanh da láng, một loại sâu lớn, gây nhiều thiệt hại trong nông nghiệp. Phương pháp được tiến hành tương tự như với đối tượng sâu tơ.
Hình 3.5. Hình ảnh thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu
Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta
sau 3 ngày thử nghiệm
STT Tên chủng Tỷ lệ sâu chết (%) Nồng độ 107 bào tử/ml Nồng độ 109 bào tử/ml 1 ĐC âm 0 0 2 ĐC dương (4J4) 33,33 77,78 3 TN 1.12 22,22 55,56 4 TN 3.4 22,22 44,44 5 TN 4.4 11,11 33,33 6 TN 5.3 11,11 44,44 7 TN 6.12 22,22 55,56 8 TN 28.6 22,22 66,67 9 TN 36.3 22,22 55,56
Số liệu bảng 3.4 cho thấy 7 chủng Bta đều có hoạt tính diệt sâu xanh da láng. Sau 3 ngày thử hoạt tính có 4/7 chủng cho tỷ lệ sâu chết lớn hơn 50% ở nồng độ 109
bào tử/ml. Trong đó, TN1.12, TN6.12, TN28.6 và TN36.3 là các chủng có hoạt tính diệt sâu cao. Sâu xanh da láng là loại sâu lớn, ăn tạp và khó diệt ngay cả bằng thuốc trừ sâu hóa học, vì thế các kết quả thử nghiệm hoạt tính diệt sâu của các chủng Bta
là tương đối khả quan.
Qua kết quả thử hoạt tính của các chủng Bta với 2 loại côn trùng thử nghiệm có thể nhận xét như sau:
- 7 chủng Bta nghiên cứu đều có hoạt tính với cả 2 loại côn trùng thử nghiệm - Các chủng TN1.12, TN6.12, TN28.6 và TN36.3 có hoạt tính diệt cao đối với cả 2 loại côn trùng thử nghiệm
Các kết quả thử hoạt tính diệt sâu nói trên là cơ sở để chúng tôi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo về gen mã hóa độc tố tinh thể.
3.1.4. Kết quả khuếch đại gen cry1C ở các chủng Bacillus thuringiensis
subsp. aizawai bằng phương pháp PCR
Gen mã hóa protein Cry1C là gen được nhiều nhà khoa học quan tâm. Do protein tinh thể Cry1C có tác dụng diệt hiệu quả nhiều loài thuộc bộ Cánh vảy, trong đó có những loài có dấu hiệu kháng thuốc trừ sâu hóa học như sâu sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura).
Chúng tôi đã sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại
gen cry1C của 7 chủng Bta có hoạt tính diệt sâu. Theo tính toán lý thuyết, đoạn gen
cry1C sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu sẽ thu được sản phẩm có kích thước 288 bp. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.6).
1 2 3 4 5 6 7 8 M
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu
Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: TN1.12, TN3.4, TN4.4, TN5.3, TN6.12, TN28.6, TN36.3, ĐC dương
M: DNA Marker
Hình ảnh điện di cho thấy, sản phẩm PCR của 7 chủng Bta trên đều cho duy nhất một băng rõ nét, có kích thước gần 300 bp như tính toán. Như vậy chúng tôi bước đầu kết luận 7 chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai nghiên cứu đều có mang gen cry1C.
Để khẳng định chính xác sự có mặt của gen cry1C trong các chủng Bta nói trên, chúng tôi chọn 3 chủng là TN28.6, TN36.3 và TN6.12 là các chủng có hoạt tính diệt sâu cao để tách dòng và xác định trình tự gen của chúng.
3.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry1C 3.2.1. Tách dòng gen cry1C
3.2.1.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy
Vector pGEM-T Easy tồn tại ở dạng mạch thẳng với 2 đầu tự do mỗi đầu thừa ra một nucleotid T nên dễ dàng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu so le A của sản phẩm PCR sử dụng Taq polymerase, vì thế chúng tôi lựa chọn vector pGEM-T Easy làm vector tách dòng.
300 bp
Đoạn gen tính toán theo lý thuyết có kích thước 288 bp thu được từ phản ứng PCR của 3 chủng được gắn trực tiếp vào vector pGEM-T Easy bằng enzyme T4- ligase ở 40C. Sản phẩm là các vector tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6, pGEM-T Easy – cry1C – TN 36.3 và pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12
3.2.1.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α
Tiến hành biến nạp 3 vector tái tổ hợp nói trên vào tế bào vi khuẩn E. coliDH5α theo phương pháp được trình bày trong phần 2.3.6.2. Các chủng vi khuẩn sau khi biến nạp được nuôi cấy trên môi trường LBA bổ sung kháng sinh Ampicillin và X - gal ở 370C.
Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh và trắng trên đĩa thạch LBA sau 14 giờ nuôi cấy
Sau 14 giờ nuôi cấy, trên đĩa thạch thấy có sự xuất hiện của các khuẩn lạc màu xanh và màu trắng (hình 3.7). Các khuẩn lạc mọc được trên môi trường chứa kháng sinh Ampicillin là các dòng vi khuẩn đã nhận được vector pGEM – T Easy có gen kháng kháng sinh Ampicillin.
Các khuẩn lạc xanh xuất hiện do vector pGEM – T Easy không chứa đoạn gen cry1C, nên gen tổng hợp enzyme ß- galactosidase vẫn hoạt động, cơ chất X – gal được chuyển hóa từ không màu sang màu xanh tràm.
Các khuẩn lạc trắng xuất hiện có thể do hai nguyên nhân sau: nguyên nhân thứ nhất có thể do tế bào vi khuẩn nhận được vector tái tổ hợp mang đoạn gen
cry1C chèn vào làm bất hoạt gen tổng hợp được enzyme ß- galactosidase. Khi đó cơ chất X - gal có trong môi trường nuôi cấy không được chuyển hóa nên khuẩn lạc không có màu xanh. Nguyên nhân thứ hai có thể là do promoter điều khiển hoạt động của gen mã hoá cho enzyme ß - galactosidase bị hỏng ngẫu nhiên, không tạo ra được enzyme ß- galactosidase, cũng tạo ra các khuẩn lạc màu trắng.
Để xác định chính xác các khuẩn lạc trắng mang vector tái tổ hợp có gen
cry1C, chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng kỹ thuật colony – PCR với cặp mồi M13. Sản phẩm colony – PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm colony - PCR với mồi M13
1,2,4: Sản phẩm colony - PCR của các dòng khuẩn trắng TN 28.6 - p3, TN36.3 - p3, TN6.12 - p7
3: Sản phẩm colony – PCR từ dòng khuẩn lạc trắng TN 6.12 – p5 5: Thang DNA chuẩn
Vector pGEM – T Easy không chứa gen ngoại lai sau phản ứng PCR với mồi M13 sẽ thu được sản phẩm có kích thước xấp xỉ 300 bp. Khi vector có đoạn gen
cry1C chèn vào thì sản phẩm PCR có kích thước trội lên đúng bằng kích thước đoạn gen này, tức là khoảng 288bp. Hình ảnh điện di cho thấy, sản phẩm colony -
1 2 3 4 5
300 bp 500 bp
PCR của các dòng khuẩn lạc trắng TN 28.6 – p3, TN 36.3 – p1 và TN 6.12 – p7 có kích thước khoảng xấp xỉ 600 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết (bằng kích thước của đoạn gen cry1C 288bp cộng với kích thước sản phẩm của mồi M13 là 300bp). Trong khi đó ở khuẩn trắng TN 6.12 – p5 chỉ thu được đoạn gen có kích thước xấp xỉ 300bp. Điều đó chứng tỏ các dòng khuẩn lạc trắng TN 28.6 – p3, TN 36.3 – p1 và TN 6.12 – p7 đã được biến nạp vector có mang gen cry1C.
3.2.1.3. Kiểm tra sự có mặt của gen cry1C trong các plasmid tái tổ hợp
Các dòng khuẩn lạc trắng đã sàng lọc bằng kỹ thuật colony - PCR được chọn để tách plasmid và kiểm tra bằng enzyme giới hạn. Do trong vùng MSC của vector pGEM – T Easey có chứa vị trí cắt của enzyme EcoRI, chúng tôi sử dụng enzyme này để tiến hành cắt kiểm tra plasmid của các các khuẩn lạc trắng đã lựa chọn, qua đó xác nhận sự có mặt của đoạn gen cry1C. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% (hình 3.9).
Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ một số dòng khuẩn lạc trắng
Giếng 1,2,4. Sản phẩm cắt DNA plasmid dòng khuẩn lạc trắng của các plasmid hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy –cry1C
– TN 36.3 - p1 và pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 Giếng 3. DNA plasmid dòng khuẩn lạc xanh (ĐC)
Giếng 5.Thang DNA chuẩn
3000 bp
300 bp
Kết quả điện di cho thấy, DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc trắng sau khi cắt bằng enzyme EcoRI tạo ra hai băng, băng lớn là vector tách dòng pGEM-T Easy có kích thước khoảng 3000 bp, băng nhỏ có kích thước gần 300