Plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy –
cry1C – TN 36.3 - p1 và pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 được chọn để đọc trình tự và so sánh với trình tự có mã số AF362020.1 trên ngân hàng gen quốc tế. Đoạn gen 288 bp của 2 chủng TN6.12 và TN36.3 có độ tương đồng 100% so với các trình tự gen cry1C của chủng Bta C002 (AF362020.1) đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế. Trong khi đó, trình tự đoạn gen cry1C của chủng TN28.6 bị mất 1 nucleotide ở vị trí 282 so với trình tự được lựa chọn để so sánh.
10 20 30 40 50 60 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AF362020.1 CAACCTCTAT TTGGTGCAGG TTCTATTAGT AGCGGTGAAC TTTATATAGA TAAAATTGAA 6.12 – p7 CAACCTCTAT TTGGTGCAGG TTCTATTAGT AGCGGTGAAC TTTATATAGA TAAAATTGAA 28.6 – p3 CAACCTCTAT TTGGTGCAGG TTCTATTAGT AGCGGTGAAC TTTATATAGA TAAAATTGAA 36.3 – p1 CAACCTCTAT TTGGTGCAGG TTCTATTAGT AGCGGTGAAC TTTATATAGA TAAAATTGAA 70 80 90 100 110 120 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AF362020.1 ATTATTCTAG CAGATGCAAC ATTTGAAGCA GAATCTGATT TAGAAAGAGC ACAAAAGGCG
6.12 – p7 ATTATTCTAG CAGATGCAAC ATTTGAAGCA GAATCTGATT TAGAAAGAGC ACAAAAGGCG 28.6 – p3 ATTATTCTAG CAGATGCAAC ATTTGAAGCA GAATCTGATT TAGAAAGAGC ACAAAAGGCG 36.3 – p1 ATTATTCTAG CAGATGCAAC ATTTGAAGCA GAATCTGATT TAGAAAGAGC ACAAAAGGCG 130 140 150 160 170 180 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AF362020.1 GTGAATGCCC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACCGATGT GACGGATTAT 6.12 – p7 GTGAATGCCC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACCGATGT GACGGATTAT 28.6 – p3 GTGAATGCCC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACCGATGT GACGGATTAT 36.3 – p1 GTGAATGCCC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACCGATGT GACGGATTAT 190 200 210 220 230 240 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AF362020.1 CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTGGAT TGTTTATCAG ATGAATTTTG TCTGGATGAA 6.12 – p7 CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTGGAT TGTTTATCAG ATGAATTTTG TCTGGATGAA 28.6 – p3 CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTGGAT TGTTTATCAG ATGAATTTTG TCTGGATGAA 36.3 – p1 CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTGGAT TGTTTATCAG ATGAATTTTG TCTGGATGAA 250 260 270 280 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|.. AF362020.1 AAGCGAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC TCAGTGA 6.12 – p7 AAGCGAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC TCAGTGA 28.6 – p3 AAGCGAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC T-AGTGA 36.3 – p1 AAGCGAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC TCAGTGA
Trình tự AF362020.1 là trình tự của gen cry1Ca mã hóa protein Cry1Ca. Như vậy, chúng tôi có thể kết luận trình tự gen cry1C của 3 chủng Bta do chúng tôi tách dòng được thuộc phân nhóm gen cry1Ca.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Từ 150 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus chưa qua phân loại, đã xác định được 54 chủng Bt sinh tinh thể, trong đó 26/54 chủng sinh 2 loại tinh thể dạng lưỡng tháp và cầu.
2. Đã phân loại được 26 chủng Bt sinh tinh thể lưỡng tháp và cầu bằng 56 typ huyết thanh chuẩn. 26 chủng Bt thuộc về 9 dưới loài khác nhau, trong đó phổ biến là các dưới loài aizawai, thuringiensis, trong đó có 10 chủng thuộc dưới loài
aizawai, chiếm tỷ lệ 38,46%.
3. Đã sàng lọc được 7 chủng Bta có hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella)
và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), trong đó 4 chủng TN 1.12, TN6.12, TN28.6 và TN 36.3 có hoạt tính diệt sâu cao nhất.
4. Đã khuếch đại được gen cry1C từ 7 chủng Bta có hoạt tính diệt sâu bằng cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR thu được có kích thước 288 bp.
5. Đã tách dòng và xác định trình tự gen cry1C của 3 chủng Bta và so sánh với trình tự có mã số AF362020.1 được công bố trên Gene Bank. Trình tự được so sánh có độ tương đồng 100% với đoạn gen cry1C của 2 chủng TN6.12 và TN36.3 và 99, 65% đối với đoạn gen cry1C của chủng TN28.6. Các gen đã tách dòng được thuộc phân nhóm gen cry1Ca.
ĐỀ NGHỊ
1. Đã xác định được trình tự đoạn gen cry1C của các chủng TN 36.3, TN 6.12 và TN 28.6 có hoạt tính diệt sâu cao. Trên cơ sở đó có thể thiết kế cặp mồi khuếch đại toàn bộ gene cry1C để tiến hành biểu hiện trên vi khuẩn E. coli.
2. Thiết kế vector biểu hiện gen cry1C trong chủng đột biến Bacillus thuringiensis (Bt51) không sinh tinh thể.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đái Duy Ban ( 2006), Công nghệ gen, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 153 2. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn Ánh
Nguyệt, Trịnh Thế Cường, Jasser Mohamad Jamil, Ngô Đình Anh Trí, Nguyễn Hoài Trâm (2000), “Nghiên cứu sự phân bố và đa dạng sinh học của Bacillus thuringiensis phân lập từ một số tỉnh ở Việt Nam”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sinh học, Báo cáo khoa học hội nghị sinh học quốc gia, tr. 484-488. 3. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Trịnh Thị Ngọt,
Nguyễn Ánh Nguyệt (2000), “Sự phân bố của Bacillus thuringiensis trong các mẫu đất của Việt Nam”, Tài nguyên sinh vật đất và sự phát triển bền vững của hệ sinh thái đất, tr. 1-7
4. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Xuân
Cảnh, Vi Thị Đoan Chính, Nguyễn Hoài Trâm, Nguyễn Văn Tuất (2003), “Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein Cry1C diệt sâu khoang từ Bacillus thuringiensis subsp. aizawai” , Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, tr. 830 – 832. 5. Ngô Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy,
Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung, Đặng Văn Tiến (2010), “35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis tại Việt Nam”, Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tr. 288 – 300.
6. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), “Thu nhận
huyết thanh miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis”, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 200-2001, tr. 296-303.
7. Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn
Quỳnh Châu, Ngô Đình Bính (2004), “ Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở Việt Nam”, Báo cáo khoa học, nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống định hướng Nông lâm nghệp miền núi, Thái Nguyên 2004, NXB KHKT, tr. 59 – 62.
8. http://www.thainguyen.gov.vn/sites/home/news/GioiThieuChung 22/03/2012
9. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2005), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục.
10.Hoàng Thị Lợi (2003), Giáo trình côn trùng học nông nghiệp tập 2, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr. 122 – 167.
11.La Thị Nga, Nguyễn Minh Dương, Trần Duy Minh, Trương Ba Hùng, Võ Thị
Thứ (2003), “Đa dạng phân tử của Bacillus thuringiensis ở các tỉnh Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ”, Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng,1.
12.Khuất Hữu Thanh (2004), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
13.Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Thúy, Ngô Đình Bính (2005),
Nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Bắc Bộ, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, số 4, tr. 29 – 34.
14.Mai Trường, Nguyễn Hữu Hổ, Lê Đức Tấn, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn
Uyển (1998), “Bước đầu chuyển gen bar, gen gusA và gen cry1Ac vào cây đậu xanh (Vigana radia L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Hội nghị toàn quốc lần thứ nhất về công nghệ sinh học cây lúa, Huế, tr. 86-87.
Tài liệu tiếng Anh
15.Abad AR, Duck NB, Feng X, Flannagan RD, Kahn TW, Sims LE (2002) Genes
encoding novel protein with pesticidal activity against coleopterans, United States Patent Appication Publication.
16.Barjac D H (1981), “Identification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis”, pp. 36 – 42
17.Barjac D H and Bonnefoi A (1962), “Essai de classification biochimique et serologique de 24 souches de Bacillus du type B. Bacillus thuringiensis.”
18.Bietlot, H. P., J. P. Shernthaner, R. E. Milne, F. R. Clairmont, R> S. Behella, and Kaplan (1993), "Envidence that the CryIA Crystal protein from Bt is associated with DNA", J. Biol. Chem. 268, pp. 8240-8245.
19. Bravo, A (1997), "Phylogenetic relationship of Bacilluc thuringiensis δ endotoxin family proteins and their funtional domains", J. Bateriol 179, pp. 2793 - 2801
20.Burges H. D (2001), "Bacillus thuringiensis in Pest control", Pesticide Outlook, pp. 90 - 98
21.Cao, J., Tang, J. D., Strizhov, N., Shelton, A. M., Earle, E. D. (1999).
“Transgenic broccoli with high levels of Bacillus thuringiensis Cry1C protein control diamondback moth larvae resistant to Cry1A or Cry1C” Mol. Breed, 5, pp. 131 - 141
22.Chen, M, Zhao, J - Z; Collins, H. L; Earle, E. D; Cao, J.; Shelton, A. M. ( 2008) “A critical assessment of the effects of Bt transgenic plants on parasitoids”
PLoS ONE , 3(5), pp. 2284.
23.Chen Yuehua, Li Hongxiu, Wang Jinhong, Cai Jun, Ren Gaixin (2004), “Cloning of full Cry1C gene from B.t.c. and expression in crops beneficial bacteria Bacillus cereus” , Wei Sheng wu xue Tong bao, 31(1), pp. 65-68
24.Deacon, J. " The microbial world: Bacillus thuringiensis",
www.helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/Bacillus thuringiensis.htm 20/06/2012 25.Dwu, XL. Cao, Y.Y. Bai, and AI. Aronson. (1991), “Sequensing of an operon
containing a novel δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis”, FEMS microbial. Lett, pp. 81-31.
26.E. Shnepf, N. Crickmore, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, J. Feitelson, D. r. Zeigler, and D. H. Dean (1998), “Bacillus thuringiensisand Its Pesticidal Crystal Proteins”, Microbiology and Molecular Biology Review, 63 (3), pp 775 – 806. 27.Ereclus D, Deléclese A and. Lecadet M. (1993), “Diversity of Bacillus
thuringiensis toxin and genes” , Bacillus thuringiensis an environmental pesticide Theory and Practice. , pp. 37 – 60.
28.Estruch, J. J., G. W. Warren, M. A. Mullins, G. J. Nye, J. A. Craig and M. G. Koziel (1996), "Vip 3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal
protein with wide spedtrum of activities against lepidotera insiects", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93, pp. 5389 - 5394.
29.Eugene W. Nester, Linda S. Thomashow, Matthew Metz and Milton Gordon (2002), 100 years of Bacillus thuringiensis: A Critical Scientific Assessment,
American Academy of Microbiology,Washington, USA
30.Grochulski, P., L. Masson, S. Borisova, M. Pusztai-Carey, J.-L. Schwartz, R. Brousseau, and M. Cygler (1995), "Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: Crystal structure and channel formation", J. Mol. Biol., 254, pp. 447- 464. 31.Herman HÖfte and H. R. Whiteley, 1989, “Insecticidal Crystal proteins of
Bacillus thuringiensis”, Microbiology Review, 53 (2), pp. 242-25.
32.Jen-Chieh Cheng, Feng-Chia Hsieh, Bing-Lan Liu, and Suey-Sheng Kao (2005), “Cloning and Expression of Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C, and Cry1Da Genes from Bacillus thuringiensis var. aizawai” The 6th Pacific Rim Conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact, Victoria BC.
33.Joseph Sambrook and David W. Russell (2001), Molecular Cloning - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
34.Klier A. (1985), Biopesticide opportunities and challegene for menegement insect, Parteun International Symposia.
35.Kronstad, J. W., and H. R. Whiteley (1986), "Three classes of homologous
Bacillus thuringiensis Crystal protein genes", Genes 43, pp. 29-40.
36.Lee, M. K., Walters, F. S., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S. Shotkoski, F. (2005), "Vip 3A: A novel insecticidal protein with the broad spectrum lepidoptera aictivity", Biotechnology of Bacillus thuringiensis, 5, pp. 231-245 37.Lee, M. K., Walters, F. S., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S. (2003), "The mode
of action of the Bacillus thuringiensis Vegetative insecticidal protein Vip2A differs from that of Cry1Ab", Appl. Environ. Microbiol, 69, pp. 4648-4657 38. Li, J., J. Caroll, and D. J. Ellar (1991), "Crystal structure of insecticidal δ endotoxin
39.Mario Soberon, Isabel Gomez, Carolina Rausell, Carlos Munoz Garray, Joan Conde, Meibao Zhuang,, Sarjeet S. Gill and Alejandra Bravo (2003), "Analysis of the Sequential Role of Cadherin and APN in Toxicity of CryAb from Bt",
Proceeding of the 5th Pacific Rim conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environment Impact, Hanoi, Vietnam.
40.Metahelix Life Sciences Private Limited, Bio - Safety Evaluation of Cry1C Protein Expressed in Bt cotton carrying Cry1C genes, Review Committee on Genetic Modifications Department of Biotechnology MST, GOI New Delhi 110003 event MLS9124
41.N. Crickmore, D. R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, , J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, D. H. Dean (1998), "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", Microbiology and Molecular Biology Reviews, pp. 807- 813.
42. N. Crickmore (2011), Bacillus thuringiensis Toxin Gene Nomenclature http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/, 27/07/2012.
43. Proceedings of the 2nd Canberra B. thuringiensis meeting Sertember, Lanberra, 1993. 44.Promega (2010), Technical Manual: pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector
Systems, Instructions for use of products A1360, A1380, A3600, A3610, USA. 45. Shin-ichiro Asano, Chikage Yamashita, Toshihiko Iizuka, Katsuyoshi
Takeuchi, Satoshi Yamanaka, David Cerf, and Takashi Yamamoto (2003), "A strain of Bacillus thurigiensis supsp. galleriae contaning a novel Cry8 gene highly toxic to Anomala cuprea", Biological Control 28, pp. 191-196.
46.Strizhov, N., Keller, M., Mathur, J., Koncz - Kalman, Z., Bosch, D., Prudovsky, E., Schell, J., Sneh, B., Koncz, C., Zil berstein, A. (1996), "A synthetic cryIC gene, encoding a Bacillus thuringiensis endotoxin, confers Spodopteraresistance in alfalfa and tobacco", L5Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93, pp. 15012-15017.
47.Suey-Shang Kao, Feng-Chia Hsieh, Ching-Chou Tzeng, Yeong Sheng Tsai (2003), "Screening, Cloning, Transformation and Expression of cry1-type Genes" Proceeding of the 5th Pacific Rim conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environment Impact, Hanoi, Vietnam.
48.Tang, W., Chen, H., Xu, C., Li, X., Lin, Y., Zhang X. (2007), "Development of insect-resistant transgenic indica rice with a synthetic cry1C gene" Mol.Breed., 18, pp. 1 -10
49. Theiry and E. Franchon (1997), “Identification, isolation, culture and preservation entomopathogenic bateria”, Biotechniques Manual of Technology in insect Pathology, Edited by Lawrence A. Lacey, Academic Press, pp. 55 – 57.
50.Wijnands L.M, Dufrene J.B, Van Leusden F.M (2002), Characterization of Bacillus Cereus. RIVM report 250912002/2002, The National Institue for Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands.