Hệ thống phân loại các gen cry đầu tiên của HÖfte và Whiteley được xây dựng dựa vào bộ côn trùng đích của độc tố mà gen mã hóa để xây dựng cây phân loại gồm có 4 nhóm chính
Nhóm gen cryI: mã hóa protein gây độc cho côn trùng bộ Cánh vảy
Nhóm gen cryII: mã hóa protein gây độc cho côn trùng bộ Hai cánh, Cánh vảy Nhóm gen cryIII: mã hóa protein gây độc cho côn trùng bộ Cánh cứng Các gen cryIV: mã hóa protein gây độc cho côn trùng bộ Hai cánh
Những gen mã hóa nhiều loại protein mà không tác động đến những vật chủ thông dụng trên được xếp vào nhóm cryV.
Hệ thống phân loại này đơn giản, dễ sử dụng nhưng cũng bộc lộ hạn chế bởi có những gen rất gần nhau về mặt phân loại nhưng lại mã hóa độc tố diệt các côn trùng thuộc các bộ khác nhau như gen cry1C mã hóa độc tố diệt côn trùng bộ Hai cánh và Cánh vảy trong khi protein cry1B lại gây độc với bộ Cánh cứng và Hai cánh [41].
Hệ thống phân loại mới do Crickmore và cs đề xuất có nhiều điểm đổi mới hiện được sử dụng rộng rãi. So với hệ thống phân loại cũ, tên của các gen được giữ nguyên, chỉ thay thế chữ số La mã bằng số Ả rập [41].
Gen mã hóa protein tinh thể được chia thành các lớp khác nhau dựa vào tỷ lệ amino acid tương đồng của protein mà chúng mã hóa. Lớp 1 (cry, cry2, cry3,…) có độ tương đồng dưới 45%, lớp 2 (cry1A, cry1B, cry1C…) có độ tương đồng từ 45% - 78%, lớp 3 (cry1Aa, cry1Ab,..) có tỷ lệ amino acid tương đồng khoảng 78% - 95%, lớp 4 là các gen mã hóa độc tố tinh thể có độ tương đồng về amino acid lên tới 99% [20], [35], [41].
Cho tới nay, hơn 600 gen mã hóa cho tổng hợp độc tố Cry đã được đọc trình tự và xếp vào trong 70 họ. Gen cry được tách dòng mới nhất được cập nhật trên cơ sở dữ liệu của Crickmore là gen cry56Aa23 (05/2012) [42].
Nhóm gen cry1:
Đây là nhóm gen được nghiên cứu chi tiết nhất, đã có 244 gen cry1 được phân tích trình tự nucleotit. Tất cả các gen cry1 đều tổng hợp protein có khối lượng khoảng 130-140 kDa, tích lũy thể vùi dạng hình tháp. Thực chất protein này là tiền độc tố, hòa tan trong môi trường kiềm của ruột giữa côn trùng và bị phân giải thành nhân độc 60-70 kDa nhờ tác dụng của protease. Nhóm gen này tổng hợp protein gây bệnh với ấu trùng côn trùng bộ Cánh vảy và Hai cánh [42], [43].
Nhóm gen cry2:
Gồm 3 lớp phụ cry2A, cry2B, cry2C mã hóa cho các protein có trọng lượng phân tử 70 kDa, thể vùi hình lập phương, protein cry2A không chỉ gây độc với H. ivesens, L. dispar, M. sexta, T. ni, P. brassie thuộc bộ Cánh vảy mà còn gây độc với cả Aedes aegypti thuộc bộ Hai cánh. Ngược lại protein Cry2B, Cry2C chỉ độc với ấu trùng bộ Cánh vảy [43].
Nhóm gen cry3:
Nhóm này gồm cry3A, cry3B, cry3C, cry3D. Trong đó, các gen cry3A, cry3B, cry3C mã hóa protein trọng lượng 73 kDa, tạo thành tinh thể hình tháp, riêng cry3D
tổng hợp protein trọng lượng 129 kDa và có tinh thể hình tháp. Độc tố do cry3 tổng hợp tác động lên ấu trùng bộ Cánh cứng [43].
Nhóm gen cry4:
Protein Cry4 có phổ tác dụng đặc trưng với côn trùng bộ Hai cánh. Nhóm gen cry4
gồm 4 gen từ cry4A, cry4B, cry4C, cry4D tổng hợp protein riêng biệt có trọng lượng phân tử lần lượt là 135 kDa, 128 kDa, 74 kDa, 72 kDa. Những protein này cùng với protein 27 kDa do gen CytA tổng hợp sinh ra phức hợp tinh thể hình trứng [27], [41].
Nhóm gen cry5:
Nhóm gen này mới được phát hiện, chúng mã hóa tổng hợp protein độc đối với côn trùng bộ Cánh vảy và bộ Cánh cứng [34].
Nhóm gen cry8:
Nhóm gen cry8 mã hóa cho các protein có hoạt lực với côn trùng thuộc bộ Cánh cứng. Cho đến nay đã xác định được khoảng gần 40 gen cry8 thuộc các dưới loài Bacillus thuringiensis khác nhau. Đây là nhóm gen mới đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [25], [45].
Nhóm gen cyt:
Mã hóa protein 27 kDa có tác dụng tiêu hủy tế bào động vật không xương sống và có xương sống bao gồm cả hồng cầu của động vật có vú. Cyt1Aa gây độc cao đối với bọ hung ăn lá bông (Chrysomela scripta) với phương thức tương tự như với ấu trùng muỗi và ruồi đen. Nhóm gen cyt có phổ gây độc đối với sâu bọ rộng hơn so với nhóm gen cry. Protein Cyt2A lớn hơn so với Cyt1A và được tìm thấy trong thể vùi của
Bacillus thuringiensis var. kyushuensis và Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis
73-E10-2[27], [41].
1.5. Tổng quan về dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai và gen cry1C 1.5.1. Một số đặc điểm của dưới loài Bta
Bacillus thuringiensis subsp. aizawai là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn Bt, thuộc typ huyết thanh số 7 theo khóa phân loại của Bonnefoi và de. Barjac, 1963. Trong số các chủng Bt phân lập ở Việt Nam có 15% số chủng là Bacillus thuringiensis subps. aizawai [3], [6].
Bacillus thuringiensis subps. aizawai hình thành tinh thể diệt sâu trong chu kì phát triển ở pha ổn định. Tinh thể có dạng hình lưỡng tháp và hình cầu nhỏ là chủ yếu. Dưới loài Bta mang gen mã hóa nhiều loại protein tinh thể của nhóm Cry1 như Cry1C, Cry1D, Cry1Aa, Cry1Ab. Vì thế Bta là một trong những dưới loài được sử dụng phổ biến nhất trong các chế phẩm từ vi khuẩn Bt. Bta có khả năng diệt nhiều loài sâu hại quan trọng như: sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura)
và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua). Bta vẫn có hiệu quả diệt sâu trên những vùng đã có biểu hiện kháng độc tố của Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki [40].
Những nghiên cứu về an toàn sinh học về Bta và các chế phẩm từ Bta cho thấy các sản phẩm thương mại từ Bta không gây độc hay ảnh hưởng tới nhiều đối tượng sinh vật như: chim, các động vật có xương sống ở nước…Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (UEPA) đã công nhận các sản phẩm từ Bta hiện đăng ký sản xuất là loại thuốc sinh học an toàn để sử dụng trên tất cả các cây nông nghiệp như cây ăn quả, rau, ngô, bông,..và cả những loài rau ăn sống [40].
Trên thị trường hiện nay, chế phẩm Xentari (Abbot), Novartis (Certa) sản xuất từ Bacillus thuringiensis subsp. aizawai được sử dụng rộng rãi và có hoạt tính diệt các loại sâu hại quan trọng đã kháng lại thuốc trừ sâu hóa học như: sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) [20], [29].
1.5.2. Gen cry1C
Gen cry1C mã hóa protein tinh thể có khối lượng phân tử khoảng 130kDa. Gen cry1C có kích thước khoảng 3kb trong đó đoạn bảo thủ mã hóa độc tố có kích thước tương đối nhỏ khoảng 288 bp. Cho đến thời điểm hiện tại đã có trên 16 gen thuộc phân nhóm cry1C được tách dòng và công bố trên cơ sở dữ liệu của Crickmore, trong đó mới nhất là gen cry1CAa14 [42].
Nhóm gen cry1 nói chung và gen cry1C nói riênglà những gen được nhiều nhà nghiên cứu Bt trên thế giới và Việt Nam quan tâm. Protein tinh thể do gen
cry1C mã hóa có hoạt tính mạnh với rất nhiều loài côn trùng thuộc bộ Cánh vảy. Năm 2004, các tác giả Chen Yuehua, Li Hongxiu, Wang Jinhong, Cai Jun, Ren Gaixin của trường Đại học Nankai, Trung Quốc đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu 1CaA/1CaB để khuếch đại toàn bộ gen cry1C từ Bacillus thuringiensis subsp. colmeri.
Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 4.0 kb gồm toàn bộ khung đọc mở và vùng điều hòa của gen cry1C. Gen cry1C sau đó được biểu hiện trong loại vi khuẩn Bacillus cereus 9509, một loài lợi khuẩn. Kết quả là vi khuẩn này đã sản sinh được protein tinh thể dạng lưỡng tháp có trọng lượng 60 kD có hoạt tính với Spodoptera exigua [23].
Năm 2005, Kao Suey-Sheng và các cs đã tiến hành sàng lọc, tách dòng, và biểu hiện nhóm gen cry1 từ 855 chủng Bt được phân lập tại các vùng trồng lúa ở Đài Loan. Các tác giả đã sử dụng kỹ thuật PCR – RFLP để phát hiện những gen mới thuộc nhóm cry 1. Kết quả cho thấy có tới 29 gen được phát hiện trong đó gồm:
cry1Ac, cry1C, cry1Cb,....[47].
Cũng trong năm 2005, nhóm tác giả Đài Loan Cheng Jen-Chieh, Hsieh Feng- Chia, Liu Bing-Lan và Kao Suey-Sheng đã tách dòng riêng rẽ bốn gen cry (cry1Aa, cry1Ab, cry1C và cry1Da) từ sản phẩm thương mại Xentari (một chế phẩm có sử dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. aizawai) và biểu hiện trong
Thuringiensis acrystalliferous B. (Cry-B) [32].
Gen cry1C đã được nghiên cứu biểu hiện trên hệ thống vi khuẩn (Pseudomonas fluorescens) và thực vật bậc cao như cải bắp, súp lơ, thuốc lá, lúa. Strizhow và cs đã tạo ra những dòng thuốc lá và cỏ alfalfa chuyển gen cry1C. Sự biểu hiện của protein cry1C
ở cây chuyển gen đã có hiệu quả bảo vệ trước sâu ăn lá bông Ai Cập (Spodoptera littoralost) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) [46].
Trong chương trình hợp tác giữa đại học Cornell của Mỹ và Viện Max – Planck, Đức, Elizabeth Earle đã biểu hiện ở mức độ cao sự tổng hợp protein cry1C
ở cây súp lơ xanh chuyển gen. Cây chuyển gen này kháng được sâu tơ, sâu đo, và sâu xanh bướm trắng [21], [22].
Theo một nghiên cứu mới từ Trung Quốc, Qifa Zhang đã tạo ra lúa chuyển gen cry1C. Cây lúa chuyển gen kháng được sâu cuốn lá lúa và sâu đục thân [48].
Tại Việt Nam, năm 2003, Ngô Đình Bính cùng các cs đã tách dòng và biểu hiện thành công gen mã hóa protein cry1C diệt sâu khoang từ Bacillus thuringiensis
subsp.aizawai phân lập từ mẫu đất ở Hà Tĩnh và Hà Nội. Protein tái tổ hợp có hoạt tính diệt sâu cao hơn so với các chủng đối chứng [4].
Qua các dữ liệu trên có thể thấy, các kết quả nghiên cứu về gen cry1C trên thế giới là khá phong phú. Trong khi đó, số lượng công trình nghiên cứu ở Việt Nam đã công bố có liên quan đến gen này vẫn còn tương đối hạn chế.
1.6. Tổng quan về côn trùng thử nghiệm
1.6.1. Sâu tơ (Plutella xylostella)
Sâu tơ (còn gọi là sâu dù). Sâu có tên khoa học là Plutella xylostella Curtis, còn có tên khác là Plutella maculipennis Curtis, thuộc họ Yponomeutidae, bộ Lepidoptera (Cánh vảy).
Sâu tơ phát triển ở hầu hết các quốc gia trồng rau cải trên thế giới. Sâu được ghi nhận là phá hoại trên rất nhiều loại rau cải khác nhau như cải bắp, cải bẹ xanh, cải bẹ trắng, cải ngọt, cải bông, nhưng trầm trọng nhất là trên cải bắp, cải bông. Ngoài ra, sâu còn gây hại trên một số loại cây họ Cà như khoai tây, cà chua...[10].
Vòng đời của sâu kéo dài khoảng 21 – 40 ngày, gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn trưởng thành: Bướm dài từ 6-10 mm. Sải cánh rộng từ 10-15 mm.
Cánh trước màu nâu xám, trên có nhiều chấm nhỏ màu nâu; từ chân cánh ra đến cạnh ngoài của cánh trước có một dải hình răng cưa màu trắng trên bướm đực và màu vàng trên bướm cái, dải này gợn sóng, nhìn có cảm giác óng ánh và lấp lánh. Thời gian sống của bướm từ 4 đến khoảng 17 ngày tùy giống cái hay đực và tùy điều kiện sống. Một bướm cái có thể đẻ đến 200 trứng, trung bình 90 trứng. Trứng hình bầu dục, dẹp, màu vàng nhạt, đường kính từ 0,3-0,5 mm. Thời gian ủ trứng từ 3-8 ngày [10].
Giai đoạn sâu non: Sâu có 4 tuổi, phát triển từ 7-15 ngày tùy điều kiện thức ăn và thời tiết. Mình sâu nở to chính giữa, hai đầu nhọn, thân chia đốt rõ ràng, mỗi đốt có nhiều lông mọc thẳng đứng. Sâu có ba cặp chân giả từ đốt bụng thứ năm. Chi tiết ở từng giai đoạn tuổi như sau:
Tuổi 1: thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm. Đến cuối tuổi này cơ thể sâu dài từ 1,2-1,5 mm. Tuổi 1 phát triển từ 2-4 ngày.
Tuổi 2: mình sâu bắt đầu chuyển sang màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục. Sâu dài từ 1,5-3,5 mm. Ở tuổi 2 sâu phát triển trong thời gian từ 1-3 ngày.
Tuổi 4: sâu có màu xanh lục sậm hơn, kích thước cơ thể từ 5,5-9 mm, phát triển từ 1-4 ngày.
Sâu tuổi 1 đục một lỗ nhỏ ở mặt dưới lá, ăn nhu mô lá, chỉ chừa lại biểu bì. Sâu tuổi 2 gặm ăn mặt dưới lá để lại lớp biểu bì mặt trên lá tạo thành những đốm trong mờ. Cuối tuổi 2 trở đi sâu gặm thủng lá. Trên một cây cải bắp bị hại nặng có thể có từ 100-300 sâu [10].
Giai đoạn nhộng: Nhộng có màu vàng, nằm trong kén mỏng.
Hình 1.9. Hình ảnh sâu tơ và (Plutella xylostella) thiệt hại do sâu tơ gây ra [10]
1.6.2. Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)
Sâu xanh da láng có tên khoa học là Spodoptera exigua Hubner, thuộc họ Noctuidae (Ngài Đêm), Lepidoptera (bộ Cánh vảy) [10].
Ở Việt Nam, nhất là ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, từ năm 1981 sâu là đối tượng gây hại chính trên đậu nành, đậu xanh, hành, ớt và một số loại hoa màu ngắn ngày khác.
Vòng đời của sâu khoảng 30 đến 40 ngày, chia thành 3 giai đoạn:
Giai đoạn trưởng thành: Bướm thuộc loại bướm đêm, màu trắng xám, chiều dài thân từ 7-10 mm, sải cánh rộng từ 20-25 mm. Đầu màu xám, mang nhiều lông, hai mắt kép to, màu đen, râu đầu hình sợi chỉ, dài từ 5-6 mm. Ngực màu nâu đỏ, được phủ kín bởi một lớp phấn màu xám tro có ánh kim. Cánh trước màu xám
hơi ngả nâu, thon dài, hình tam giác, góc cánh hơi bầu, có nhiều vân. Thời gian sống của bướm từ 5 -10 ngày, một bướm cái có thể đẻ từ 300-400 trứng trong vòng từ 3-5 ngày [10].
Trứng có hình cầu, đường kính từ 0,4-0,5 mm, mới đẻ màu xanh đến vàng nhạt, sau chuyển sang màu trắng đục, sắp nở có một chấm đen trên vỏ trứng, đó là mắt của sâu. Thời gian ủ trứng từ 2 - 4 ngày.
Giai đoạn sâu non: Sâu có từ 5-6 tuổi, phát triển trong thời gian từ 10-19 ngày. Mặt lưng của sâu màu xanh và trơn láng nên còn có tên là "Sâu xanh da láng" để phân biệt với sâu xanh (Heliothis armigera). Chi tiết trong từng tuổi sâu như sau: Tuổi 1: thân sâu có màu xanh lá cây hay vàng xanh, đầu đen bóng, mang nhiều lông, bụng màu vàng nhạt, cơ thể có chiều dài từ 1,2-1,5 mm. Thời gian phát triển của sâu ở tuổi này từ 2 - 5 ngày.
Từ tuổi 2, màu sắc trên mình sâu bắt đầu thể hiện rõ dần. Bụng màu vàng xanh, các đốt trên thân phân biệt rõ dần. Mình sâu có 3 sọc màu trắng mờ, một sọc giữa lưng và 2 sọc ở hai bên thân. Ở tuổi này sâu có kích thước cơ thể trung bình là 0,45x3,7mm. Thời gian phát triển của sâu tuổi 2 từ 2-4 ngày.
Sang tuổi 3, sâu có màu vàng xanh, sau chuyển sang màu xanh lá cây. Các chấm trên mình sâu nhỏ dần, lông ngắn hơn. Thời gian phát triển của sâu ở tuổi này từ 2-3 ngày.
Sau khi nở sâu sống tập trung quanh ổ trứng, ăn phần diệp lục của lá thành những lỗ nhỏ. Cuối tuổi 1 sâu bắt đầu phân tán sang các lá lân cận. Ấu trùng tuổi 2 ăn thủng lá thành những lỗ nhỏ và có tập quán nhả tơ buông mình xuống đất khi bị động. Ở tuổi 3 sâu ăn phá mạnh nhất, cắn lá thành những lỗ to; sâu còn đeo trên các chùm hoa của cây đậu nành và ăn các cánh hoa vừa mới nhú. Ở những ruộng có mật số cao sâu ăn lá còn trơ gân chính và cuống và cả trái non [10].
Giai đoạn nhộng: Kéo dài từ 7 – 10 ngày, sâu thường hóa nhộng trong đất
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
150 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus (B.cereus) phân lập từ các mẫu đất ở Thái Nguyên do Phòng Di truyền Vi sinh vật cung cấp.
Các chủng vi khuẩn E .coli do phòng Di truyền Vi sinh vật cung cấp.
Kit huyết thanh miễn dịch chuẩn thu nhận từ Phòng Di truyền Vi sinh vật.
Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR