- Các chủng Bt được nuôi trên môi trường MPA ở nhiệt độ 280C, sau 3 ngày tiến hành thu sinh khối.
- Sinh khối được xử lý nhiệt ở 650C - 700C trong 30 phút sau đó pha loãng đến nồng độ 10-7
` - Sử dụng 100µl dịch ở 2 nồng độ pha loãng 10-6 và 10-7 cấy trang trên đĩa petri chứa môi trường MPA.
- Nuôi ở 280C, sau 24 giờ đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa. - Từ đó số lượng bào tử được tính theo công thức sau
CFU = n.a.10 (CFU: Colony forming unit: đơn vị hình thành khuẩn lạc) Trong đó:
CFU : số lượng bào tử trong 1ml dịch nuôi cấy
n: số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100 dịch pha loãng. a: nồng độ pha loãng.
2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính với côn trùng thử nghiệm
Để đánh giá khả năng diệt côn trùng bộ Cánh vảy của các chủng Bt nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên đối tượng sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) theo phương pháp của Thiery và Frachon ở hai nồng độ là 107
và 109 bào tử/ml đối với sâu xanh da láng và nồng độ 105 và 107 bào tử/ml đối với sâu tơ [43]. Mỗi nồng độ được thử nghiệm với 3 đĩa petri.
Chuẩn bị:
- Các chủng Bacillus thuringiensis được cấy traỉ trên môi trường MPA, nuôi ở 280C trong 72 giờ.
- Thu sinh khối tế bào, bảo quản trong ống eppendoft có chứa 1,5ml nước cất vô trùng.
- Pha loãng sinh khối đến nồng độ 109 bào tử/ ml để thử hoạt tính.
Tiến hành:
- Lá rau rửa sạch, để khô.
- Tẩm lá với dịch có sinh khối Bacillus thuringiensis ở các nồng độ 2 nồng độ pha loãng nói trên, để lá khô tự nhiên.
- Đặt giấy thấm Whatman No.1 đã khử trùng vào đĩa. - Đặt lá rau đã tẩm Bacillus thuringiensis lên trên giấy.
- Mỗi đĩa thả 03 con sâu (đối với sâu xanh da láng), 10 con sâu/đĩa (đối với sâu tơ)
- Theo dõi kết quả trong 3 ngày.
Sau khi kết thúc thí nghiệm tỷ lệ sâu chết được xác định theo công thức Abbott: A=(C - T)/C.100
Trong đó:
A: % sâu chết.
C: số sâu sống ở mẫu đối chứng âm. T: số sâu sống ở mẫu thí nghiệm.
2.3.5. Phương pháp tách DNA plasmid
Phương pháp tách chiết DNA plasmid được tiến hành theo phương pháp được mô tả trong tài liệu của Joseph Sambrook và David W. Russell [33].
Các chủng vi khuẩn được cấy vào ống nghiệm có chứa 1,5ml môi trường MPB, nuôi lắc 200 vòng/phút, nuôi qua đêm ở 280C
Hút 1,5ml dịch nuôi cấy vào ống efppendorf.
Ly tâm 6000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40
C, thu cặn
Bổ sung vào mỗi ống 150µl sol 1 và vortex làm tan tủa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bổ sung vào mỗi ống 150µl sol 2 và đảo nhẹ.
Bổ sung vào mỗi ống 150µl sol 3 và đảo nhẹ.
Bổ sung 1ml cồn tuyệt đối vào mỗi ống 1 ủ ở -200
C trong 3 giờ
Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Thu cặn và làm khô
Hoà tan DNA plasmid bằng 45µl RNAase và bảo quản ở -200C.
2.3.6. Phương pháp PCR để khuếch đại gen cry1C
Phương pháp PCR thực chất là một phương pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào, nhằm mục đích thu nhận một số lượng lớn bản sao của một trình tự DNA xác định [33]. Thành phần phản ứng PCR: Thành phần Thể tích (µl) 10x PCR buffer included Mg++ 2 µl 10mm dNTP mix 2µl Mồi xuôi 1µl Mồi ngược 1µl DNA mẫu 2µl
Taq DNA polymerase (5u/µl) 0,2µl
dH2O 11,8µl
Tổng thể tích 20µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen cry1C
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agrarose 1%.
2.3.7. Phương pháp tách dòng gen cry1C
2.3.7.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy
Một trong những vector tạo dòng nhân tạo thuộc thế hệ mới nhất và được sử dụng phổ biến hiện nay là vector pGEM-T Easy [44]
940C, 2’ 520C, 1’ 72 0C, 1’ 720C, 10’ 40C, ∞ 30 chu kỳ 940C, 1’
Vector PGEM – T Easy [44] Phƣơng pháp tiến hành:
- Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối T4- ligase. Phản ứng nối ghép được tiến hành với tổng thể tích là 10µl.
- Quá trình nối ghép được tiến hành ở 40C trong 14-16 giờ
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
10x ligation buffer 5µl
pGEM-T Easy 1µl
Sản phẩm PCR (10ng) 3µl
T4 DNA ligase 1µl
2.3.7.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α
Nguyên tắc
Dưới tác dụng của CaCl2 thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở lên xốp tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt [33].
Quy trình gồm 2 bƣớc:
* Tạo tế bào khả biến bằng muối CaCl2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cấy chuyển một khuẩn lạc E. coli DH5α vào 5ml môi trường LB, lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 370C qua đêm.
- Cấy chuyển 3ml dịch tế bào nuôi cấy qua đêm vào 30 ml môi trường LB, nuôi lắc trong 1,5 giờ để OD600 đạt 0,4-0,6, sau đó đặt trên đá trong 1 giờ. Tất cả các bước tiếp theo đều tiến hành ở 40
C.
- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn. Cặn ly tâm được hòa tan trong 1 ml dung dịch muối CaCl2 100mM lạnh, vô trùng rồi đem ủ trên đá khoảng 15 phút.
- Tiếp tục ly tâm ở cùng điều kiện, thu cặn và hòa tan bằng dung dịch CaCl2 100mM, sau đó ủ đá trong 1h.
- Ly tâm thu tế bào ở 4000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó bổ sung 1 ml CaCl2 100mM lạnh, vô trùng có chứa 15% glyxerol. Chia vào mỗi ống eppendorf 100 μl tế bào và giữ tế bào ở -800C để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
* Biến nạp:
- Tế bào khả biến lấy ra từ tủ -800C được làm tan từ từ trên đá.
- Bổ sung 5μl vector tái tổ hợp vào 100μl tế bào khả biến, đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều, tiếp tục ủ đá 30 phút.
- Sốc nhiệt: Mẫu đang đặt trong đá được để ngay vào bể ổn nhiệt có nhiệt độ 420C trong 1 phút. Sau đó mẫu lại được lấy ra và đặt nhanh lên đá trong 2 phút.
- Bổ sung 200μl môi trường LB và lắc 200 vòng/phút trong 1-1,5 giờ ở 370C. - Sử dụng 100μl dịch cấy trải trên 1 đĩa môi trường LBA có bổ sung kháng sinh Ampiciline 50 g/ml + Xgal 80 g/ml, nuôi qua đêm ở 370C .
2.3.7.3. Sàng lọc khuẩn lạc bằng kỹ thuật colony - PCR với mồi M13
- Các thành phần phản ứng colony - PCR tương tự như phản ứng khuếch đại gen cry1C với mồi đặc hiệu, chỉ khác ở chỗ DNA template được thay thế bằng một lượng nhỏ sinh khối từ các khuẩn lạc trắng và sử dụng cặp mồi M13.
- Chu trình nhiệt:
940C: 5’ 550C: 1’30s 720C: 7’
940C: 1’ 720C:1’ 40C: ∞
2.3.7.4. Tách plasmid của vi khuẩn E. coli DH5α
Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli DH5α được nuôi lắc trong môi trường LB có bổ sung kháng sinh Amp 50μg/ml, ở nhiệt độ 370C trong 12 – 14h.
Các bước tách DNA plasmid sau đó tiến hành tương tự như với vi khuẩn Bt. 2.3.7.5. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzyme giới hạn
Vùng mcs của vector pGEM – T Easy có chứa trình tự cắt của enzyme EcoRI, vì thế có thể sử dụng enzyme này kiểm tra các vector đã được biến nạp vào tế bào
E. coli DH5α có mang đoạn gen đang nghiên cứu hay không [33,12]. Phản ứng cắt được thực hiện trong 4 giờ.
Trình tự cắt của enzyme EcoRI 5’……….GAATTC…………3’
3’………..CTTAAG…………..5’ Thành phần của phản ứng cắt: Thành phần Thể tích (µl) DNA plasmide 6µl Buffer 1µl EcoRI 0,5µl dH2O 2.5µl Tổng thể tích 10µl
2.3.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotid của đoạn gen tách dòng
Trình tự nucleotid của đoạn gen tách dòng được xác định theo phương pháp tổng hợp của Sanger và cs [1], [12], [33].
Thực hiện phản ứng PCR ngoài các thành phần thông thường được bổ sung thêm 4 loại dideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) đã được đánh dấu huỳnh quang.
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide có bổ sung ure để làm tăng độ phân giải của gen. Dùng tia laze quét để phát hiện dideoxynucleotid đánh dấu.
Xử lý kết quả bằng phần mềm PC/gene, sau đó tiến hành so sánh trình tự gen đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong ngân hàng gen quốc tế.
2.4. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Di truyền Vi sinh vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp. aizawai mang gen cry1C
có hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 3.1.1. Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành hoạt hóa 150 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus
chưa qua phân loại trên môi trường MPA. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 280C, trên đĩa thạch mọc lên các khuẩn lạc có hình thái giống khuẩn lạc nhóm Bacillus cereus. Đó là những khuẩn lạc tròn, có màu trắng sữa, mép khuẩn lạc có thể có răng cưa (hình 3.1).
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trƣờng MPA sau 72 giờ nuôi cấy ở 280C
Từ mỗi đĩa nuôi cấy chúng tôi tách lấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ làm tiêu bản với thuốc nhuộm fucshin base sau đó quan sát trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100X (vật kính dầu). Kết quả cho thấy, trong số 150 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus đã thu thập, có 54 chủng Bacillus thuringiensis sinh tinh thể. Kết quả phân loại hình dạng tinh thể được thể hiện trong hình 3.2, bảng 3.1
Bảng 3.1. Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu
STT Hình dạng Số chủng Tỷ lệ % 1 Lưỡng tháp 21 39 2 Cầu 4 7 3 Lưỡng tháp và cầu 26 48 4 Lập phương 1 2 5 Cầu và lập phương 1 2 6 Không xác định 1 2 Tổng số 54 100
Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của chủng TN1.12 và TN 36.3 phóng đại 100X dƣới kính hiển vi quang học (vật kính dầu)
Số liệu thống kê ở bảng 3.1 cho thấy, tinh thể của 54 chủng Bacillus thuringiensis
có 4 dạng chính: lưỡng tháp, cầu, lập phương và một số dạng không xác định. Trong 54 chủng sinh tinh thể, chiếm tỷ lệ cao nhất (48%) là các chủng sinh tinh 2 loại tinh thể hình lưỡng tháp và cầu. Tiếp đó là các chủng sinh 1 loại tinh thể hình lưỡng tháp (39%). Các chủng sinh tinh thể hình cầu, lập phương và đồng thời 2 loại tinh thể này chiếm tỷ lệ tương đối thấp, từ 2% đến 7%.
Qua kết quả trên có thể thấy các chủng Bt phân lập từ đất Thái Nguyên có độ đa dạng cao về dạng tinh thể. Sự khác nhau về cấu trúc cũng như hình dạng tinh thể là do thành phần protein cấu tạo tinh thể tạo nên. Sự phong phú về dạng tinh thể có thể dẫn tới sự đa dạng về độc tố Cry, là cơ sở tạo nên phổ diệt côn trùng rộng cho các chủng Bt nghiên cứu.
Theo nhiều công bố, dưới loài Bta chủ yếu sinh tổng hợp 2 loại tinh thể có dạng cầu và lưỡng tháp. Vì thế trong số các chủng sinh tinh thể, chúng tôi quan tâm tới các chủng sinh 2 loại tinh thể cầu và lưỡng tháp. Chúng có khả năng là các chủng thuộc dưới loài Bta cần tuyển chọn.
3.1.2. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis được chia thành nhiều dưới loài khác nhau. Các dưới loài được phân loại nhờ phản ứng ngưng kết với typ huyết thanh đặc trưng của chúng. Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai thuộc typ huyết thanh H7.
Để sàng lọc các chủng Bt thuộc dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai từ 26 chủng Bt sinh tinh thể cầu và lưỡng tháp, chúng tôi sử dụng phương pháp huyết thanh học đã mô tả trong mục 2.2.1 với bộ 56 huyết thanh do phòng Di truyền Vi sinh cung cấp. Các chủng Bt thuộc dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai sẽ có phản ứng ngưng kết với typ huyết thanh H7 . Kết quả phân loại dưới loài được thể hiện ở hình 3.3 và bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả phân loại dƣới loài của các chủng Bt sinh tinh thể
STT Dưới loài Bacillus
thuringiensis Typ huyết thanh Số chủng ngưng kết Tỷ lệ (%) 1 toguchini 31 1 3,84 2 aizawai 7 10 38,46 3 tochigiensis 19 2 7,69 4 asturiensis 53 1 3,85 5 thuringensis 1 5 19,23 6 sotto 4 1 3,85 7 tolworthi 9 1 3,85 8 canadensis 5 2 7,69 9 kim 52 2 7,69 10 Không ngưng kết 1 3,85 Tổng 9 26 100 Hình 3.3. Hình ảnh ngƣng kết của chủng 4J4 (A) và TN 6.12 (B) với typ huyết thanh H7 dƣới kính hiển vi quang học
Kết quả phân loại cho thấy có 25/26 chủng có phản ứng ngưng kết với 56 loại huyết thanh được dùng để thử. Các chủng ngưng kết thuộc về 9 dưới loài khác nhau. Trong tổng số 9 dưới loài đã được phân loại, có 2 dưới loài chiếm ưu thế, trong đó dưới loài aizawai chiếm tới 38,46%, xếp thứ hai là dưới loài thuringiensis
chiếm 19,23%, các dưới loài còn lại chiếm tỷ lệ từ 3,84% đến 7,69%. Ngoài ra, trong tổng số 26 chủng có 1 chủng không ngưng kết với bất kỳ typ huyết thanh nào. Đây có thể là các chủng thuộc các dưới loài khác hoặc dưới loài mới chưa được phát hiện.
Các chủng Bt được phân loại sẽ được bổ sung vào tập đoàn chủng giống Bt của phòng Di truyền Vi sinh vật, 10 chủng Bta đã phân loại được bằng phương pháp huyết thanh học kể trên, chúng tôi sử dụng cho các bước sàng lọc tiếp theo.
3.1.3. Thử hoạt tính của các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai trên sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)
Chúng tôi tiến hành thử hoạt tính diệt côn trùng bộ Cánh vảy của các chủng
Bta đã phân loại được nhằm chọn ra những chủng có hoạt tính diệt sâu cao. Côn trùng thử nghiệm là sâu xanh da láng và sâu tơ là 2 loại sâu phá hoại nghiêm trọng nhiều loại cây nông ngiệp.
3.1.3.1. Xác định nồng độ bào tử
Vi khuẩn Bt trong giai đoạn tạo bào tử sẽ đồng thời sinh tổng hợp các tinh thể độc. Thông qua nồng độ bào tử có thể gián tiếp ước lượng nồng độ tinh thể của các chủng nghiên cứu. Do đó chúng tôi tiến hành xác định nồng độ bào tử của các chủng Bta nghiên cứu cùng với chủng Bta chuẩn làm đối chứng dương. Phương pháp xác định nồng độ bào tử của các chủng Bta được trình bày ở mục 2.3.3.
Nồng độ bào tử của các chủng thử dao động từ 2,5.109 đến 5.109 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bào tử/ml. Chúng tôi đã chọn ra 7 chủng Bta có nồng độ bào tử cao để tiến hành thử hoạt tính với côn trùng thử nghiệm, đó là các chủng: TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN5.3, TN 6.12, TN 28.6 và TN 36.3
Sinh khối của 7 chủng Bta được pha loãng nhiều lần, chúng tôi sử dụng nồng độ nồng 105 bào tử/ml và 107 bào tử/ml để thử hoạt tính với sâu tơ và nồng độ 107
3.1.3.2. Kết quả thử hoạt tính của các chủng Bta đối với sâu tơ và sâu xanh da láng
* Kết quả thử hoạt tính trên sâu tơ (Plutella xylostella)
Với 7 chủng Bta đã lựa chọn, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên đối tượng sâu tơ, tỷ lệ sâu chết được theo dõi trong 3 ngày và tính toán theo công thức Abbott. Kết quả thử nghiệm được trình bày trong hình 3.4 và bảng 3.3.
Hình 3.4. Thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta
sau 3 ngày thử nghiệm.
STT Tên chủng Tỷ lệ sâu chết (%) Nồng độ 105 bào tử/ml Nồng độ 10 7 bào tử/ml 1 ĐC âm 0 0 2 ĐC dương (4J4) 76,67 93,33 3 TN 1.12 53,33 80,00 4 TN 3.4 63,33 83,33