subsp. aizawai bằng phương pháp PCR
Gen mã hóa protein Cry1C là gen được nhiều nhà khoa học quan tâm. Do protein tinh thể Cry1C có tác dụng diệt hiệu quả nhiều loài thuộc bộ Cánh vảy, trong đó có những loài có dấu hiệu kháng thuốc trừ sâu hóa học như sâu sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura).
Chúng tôi đã sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại
gen cry1C của 7 chủng Bta có hoạt tính diệt sâu. Theo tính toán lý thuyết, đoạn gen
cry1C sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu sẽ thu được sản phẩm có kích thước 288 bp. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.6).
1 2 3 4 5 6 7 8
M
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu
Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: TN1.12, TN3.4, TN4.4, TN5.3, TN6.12, TN28.6, TN36.3, ĐC dương
M: DNA Marker
Hình ảnh điện di cho thấy, sản phẩm PCR của 7 chủng Bta trên đều cho duy nhất một băng rõ nét, có kích thước gần 300 bp như tính toán. Như vậy chúng tôi bước đầu kết luận 7 chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai nghiên cứu đều có mang gen cry1C.
Để khẳng định chính xác sự có mặt của gen cry1C trong các chủng Bta nói trên, chúng tôi chọn 3 chủng là TN28.6, TN36.3 và TN6.12 là các chủng có hoạt tính diệt sâu cao để tách dòng và xác định trình tự gen của chúng.
3.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry1C 3.2.1. Tách dòng gen cry1C
3.2.1.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy
Vector pGEM-T Easy tồn tại ở dạng mạch thẳng với 2 đầu tự do mỗi đầu thừa ra một nucleotid T nên dễ dàng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu so le A của sản phẩm PCR sử dụng Taq polymerase, vì thế chúng tôi lựa chọn vector pGEM-T Easy làm vector tách dòng.
300 bp
Đoạn gen tính toán theo lý thuyết có kích thước 288 bp thu được từ phản ứng PCR của 3 chủng được gắn trực tiếp vào vector pGEM-T Easy bằng enzyme T4- ligase ở 40C. Sản phẩm là các vector tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6, pGEM-T Easy – cry1C – TN 36.3 và pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12
3.2.1.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α
Tiến hành biến nạp 3 vector tái tổ hợp nói trên vào tế bào vi khuẩn E. coliDH5α theo phương pháp được trình bày trong phần 2.3.6.2. Các chủng vi khuẩn sau khi biến nạp được nuôi cấy trên môi trường LBA bổ sung kháng sinh Ampicillin và X - gal ở 370C.
Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh và trắng trên đĩa thạch LBA sau 14 giờ nuôi cấy
Sau 14 giờ nuôi cấy, trên đĩa thạch thấy có sự xuất hiện của các khuẩn lạc màu xanh và màu trắng (hình 3.7). Các khuẩn lạc mọc được trên môi trường chứa kháng sinh Ampicillin là các dòng vi khuẩn đã nhận được vector pGEM – T Easy có gen kháng kháng sinh Ampicillin.
Các khuẩn lạc xanh xuất hiện do vector pGEM – T Easy không chứa đoạn gen cry1C, nên gen tổng hợp enzyme ß- galactosidase vẫn hoạt động, cơ chất X – gal được chuyển hóa từ không màu sang màu xanh tràm.
Các khuẩn lạc trắng xuất hiện có thể do hai nguyên nhân sau: nguyên nhân thứ nhất có thể do tế bào vi khuẩn nhận được vector tái tổ hợp mang đoạn gen
cry1C chèn vào làm bất hoạt gen tổng hợp được enzyme ß- galactosidase. Khi đó cơ chất X - gal có trong môi trường nuôi cấy không được chuyển hóa nên khuẩn lạc không có màu xanh. Nguyên nhân thứ hai có thể là do promoter điều khiển hoạt động của gen mã hoá cho enzyme ß - galactosidase bị hỏng ngẫu nhiên, không tạo ra được enzyme ß- galactosidase, cũng tạo ra các khuẩn lạc màu trắng.
Để xác định chính xác các khuẩn lạc trắng mang vector tái tổ hợp có gen
cry1C, chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng kỹ thuật colony – PCR với cặp mồi M13. Sản phẩm colony – PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm colony - PCR với mồi M13
1,2,4: Sản phẩm colony - PCR của các dòng khuẩn trắng TN 28.6 - p3, TN36.3 - p3, TN6.12 - p7
3: Sản phẩm colony – PCR từ dòng khuẩn lạc trắng TN 6.12 – p5 5: Thang DNA chuẩn
Vector pGEM – T Easy không chứa gen ngoại lai sau phản ứng PCR với mồi M13 sẽ thu được sản phẩm có kích thước xấp xỉ 300 bp. Khi vector có đoạn gen
cry1C chèn vào thì sản phẩm PCR có kích thước trội lên đúng bằng kích thước
đoạn gen này, tức là khoảng 288bp. Hình ảnh điện di cho thấy, sản phẩm colony -
1 2 3 4 5
300 bp
500 bp
PCR của các dòng khuẩn lạc trắng TN 28.6 – p3, TN 36.3 – p1 và TN 6.12 – p7 có kích thước khoảng xấp xỉ 600 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết (bằng kích thước của đoạn gen cry1C 288bp cộng với kích thước sản phẩm của mồi M13 là 300bp). Trong khi đó ở khuẩn trắng TN 6.12 – p5 chỉ thu được đoạn gen có kích thước xấp xỉ 300bp. Điều đó chứng tỏ các dòng khuẩn lạc trắng TN 28.6 – p3, TN 36.3 – p1 và TN 6.12 – p7 đã được biến nạp vector có mang gen cry1C.
3.2.1.3. Kiểm tra sự có mặt của gen cry1C trong các plasmid tái tổ hợp
Các dòng khuẩn lạc trắng đã sàng lọc bằng kỹ thuật colony - PCR được chọn để tách plasmid và kiểm tra bằng enzyme giới hạn. Do trong vùng MSC của vector pGEM – T Easey có chứa vị trí cắt của enzyme EcoRI, chúng tôi sử dụng enzyme này để tiến hành cắt kiểm tra plasmid của các các khuẩn lạc trắng đã lựa chọn, qua đó xác nhận sự có mặt của đoạn gen cry1C. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% (hình 3.9).
Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ một số dòng khuẩn lạc trắng
Giếng 1,2,4. Sản phẩm cắt DNA plasmid dòng khuẩn lạc trắng của các plasmid hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy –cry1C
– TN 36.3 - p1 và pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 Giếng 3. DNA plasmid dòng khuẩn lạc xanh (ĐC)
Giếng 5.Thang DNA chuẩn
3000 bp
300 bp
Kết quả điện di cho thấy, DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc trắng sau khi cắt bằng enzyme EcoRI tạo ra hai băng, băng lớn là vector tách dòng pGEM-T Easy có kích thước khoảng 3000 bp, băng nhỏ có kích thước gần 300 bp tương ứng với sản phẩm PCR của gen cry1C.
Qua kết quả trên có thể bước đầu khẳng định các dòng khuẩn lạc TN28.6 - p3, TN 36.3 - p1, TN 6.12 – p7 đã được biến nạp vector tái tổ hợp mang gen
cry1C. Mặt khác, quá trình tách dòng không làm ảnh hưởng tới vị trí cắt của enzyme EcoRI trên vùng MCS của vector tách dòng.
Để khẳng định chắc chắn sự có mặt của gen cry1C trong plasmid của các dòng vi khuẩn nói trên, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu TYIC 5 và TYIUNI 5 từ DNA plasmid tái tổ hợp của các khuẩn lạc trắng đã kiểm tra bằng EcoRI. Kết quả được thể hiện trong hình 3.10.
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen cry1C từ DNA plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 36.3 -
p1 và pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7
Từ các kết quả thu được, chúng tôi bước đầu kết luận đã tách dòng thành công gen cry1C bằng vector tách dòng pGEM – T Easy trong vi khuẩn E. coli. Tuy nhiên, để có thể kết luận chính xác đoạn gen đã tách dòng có phải là gen cry1C hay không chúng tôi tiến hành đọc trình tự 3 đoạn gen này và so sánh với các trình tự gen đã đăng ký trong Ngân hàng Gen quốc tế.
300 bp
3.2.2. Xác định trình tự đoạn gen cry1C
Plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy –
cry1C – TN 36.3 - p1 và pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 được chọn để đọc trình tự và so sánh với trình tự có mã số AF362020.1 trên ngân hàng gen quốc tế. Đoạn gen 288 bp của 2 chủng TN6.12 và TN36.3 có độ tương đồng 100% so với các trình tự gen cry1C của chủng Bta C002 (AF362020.1) đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế. Trong khi đó, trình tự đoạn gen cry1C của chủng TN28.6 bị mất 1 nucleotide ở vị trí 282 so với trình tự được lựa chọn để so sánh.
10 20 30 40 50 60 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AF362020.1 CAACCTCTAT TTGGTGCAGG TTCTATTAGT AGCGGTGAAC TTTATATAGA TAAAATTGAA 6.12 – p7 CAACCTCTAT TTGGTGCAGG TTCTATTAGT AGCGGTGAAC TTTATATAGA TAAAATTGAA 28.6 – p3 CAACCTCTAT TTGGTGCAGG TTCTATTAGT AGCGGTGAAC TTTATATAGA TAAAATTGAA 36.3 – p1 CAACCTCTAT TTGGTGCAGG TTCTATTAGT AGCGGTGAAC TTTATATAGA TAAAATTGAA 70 80 90 100 110 120 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AF362020.1 ATTATTCTAG CAGATGCAAC ATTTGAAGCA GAATCTGATT TAGAAAGAGC ACAAAAGGCG
6.12 – p7 ATTATTCTAG CAGATGCAAC ATTTGAAGCA GAATCTGATT TAGAAAGAGC ACAAAAGGCG 28.6 – p3 ATTATTCTAG CAGATGCAAC ATTTGAAGCA GAATCTGATT TAGAAAGAGC ACAAAAGGCG 36.3 – p1 ATTATTCTAG CAGATGCAAC ATTTGAAGCA GAATCTGATT TAGAAAGAGC ACAAAAGGCG 130 140 150 160 170 180 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AF362020.1 GTGAATGCCC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACCGATGT GACGGATTAT 6.12 – p7 GTGAATGCCC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACCGATGT GACGGATTAT 28.6 – p3 GTGAATGCCC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACCGATGT GACGGATTAT 36.3 – p1 GTGAATGCCC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACCGATGT GACGGATTAT 190 200 210 220 230 240 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| AF362020.1 CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTGGAT TGTTTATCAG ATGAATTTTG TCTGGATGAA 6.12 – p7 CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTGGAT TGTTTATCAG ATGAATTTTG TCTGGATGAA 28.6 – p3 CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTGGAT TGTTTATCAG ATGAATTTTG TCTGGATGAA 36.3 – p1 CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTGGAT TGTTTATCAG ATGAATTTTG TCTGGATGAA 250 260 270 280 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|.. AF362020.1 AAGCGAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC TCAGTGA 6.12 – p7 AAGCGAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC TCAGTGA 28.6 – p3 AAGCGAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC T-AGTGA 36.3 – p1 AAGCGAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC TCAGTGA
Trình tự AF362020.1 là trình tự của gen cry1Ca mã hóa protein Cry1Ca. Như vậy, chúng tôi có thể kết luận trình tự gen cry1C của 3 chủng Bta do chúng tôi tách dòng được thuộc phân nhóm gen cry1Ca.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Từ 150 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus chưa qua phân loại, đã xác định được 54 chủng Bt sinh tinh thể, trong đó 26/54 chủng sinh 2 loại tinh thể dạng lưỡng tháp và cầu.
2. Đã phân loại được 26 chủng Bt sinh tinh thể lưỡng tháp và cầu bằng 56 typ
huyết thanh chuẩn. 26 chủng Bt thuộc về 9 dưới loài khác nhau, trong đó phổ biến
là các dưới loài aizawai, thuringiensis, trong đó có 10 chủng thuộc dưới loài
aizawai, chiếm tỷ lệ 38,46%.
3. Đã sàng lọc được 7 chủng Bta có hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella)
và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), trong đó 4 chủng TN 1.12, TN6.12, TN28.6 và TN 36.3 có hoạt tính diệt sâu cao nhất.
4. Đã khuếch đại được gen cry1C từ 7 chủng Bta có hoạt tính diệt sâu bằng cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR thu được có kích thước 288 bp.
5. Đã tách dòng và xác định trình tự gen cry1C của 3 chủng Bta và so sánh với trình tự có mã số AF362020.1 được công bố trên Gene Bank. Trình tự được so sánh có độ tương đồng 100% với đoạn gen cry1C của 2 chủng TN6.12 và TN36.3 và 99, 65% đối với đoạn gen cry1C của chủng TN28.6. Các gen đã tách dòng được thuộc phân nhóm gen cry1Ca.
ĐỀ NGHỊ
1. Đã xác định được trình tự đoạn gen cry1C của các chủng TN 36.3, TN 6.12 và TN 28.6 có hoạt tính diệt sâu cao. Trên cơ sở đó có thể thiết kế cặp mồi khuếch đại toàn bộ gene cry1C để tiến hành biểu hiện trên vi khuẩn E. coli.
2. Thiết kế vector biểu hiện gen cry1C trong chủng đột biến Bacillus thuringiensis (Bt51) không sinh tinh thể.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đái Duy Ban ( 2006), Công nghệ gen, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 153 2. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn Ánh
Nguyệt, Trịnh Thế Cường, Jasser Mohamad Jamil, Ngô Đình Anh Trí, Nguyễn Hoài Trâm (2000), “Nghiên cứu sự phân bố và đa dạng sinh học của Bacillus thuringiensis phân lập từ một số tỉnh ở Việt Nam”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sinh học, Báo cáo khoa học hội nghị sinh học quốc gia, tr. 484-488. 3. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Trịnh Thị Ngọt,
Nguyễn Ánh Nguyệt (2000), “Sự phân bố của Bacillus thuringiensis trong các mẫu đất của Việt Nam”, Tài nguyên sinh vật đất và sự phát triển bền vững của hệ sinh thái đất, tr. 1-7
4. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Xuân
Cảnh, Vi Thị Đoan Chính, Nguyễn Hoài Trâm, Nguyễn Văn Tuất (2003), “Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein Cry1C diệt sâu khoang từ Bacillus thuringiensis subsp. aizawai” , Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, tr. 830 – 832. 5. Ngô Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy,
Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung, Đặng Văn Tiến (2010), “35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis tại Việt Nam”, Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tr. 288 – 300.
6. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), “Thu nhận
huyết thanh miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis”, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 200-2001, tr. 296-303.
7. Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn
Quỳnh Châu, Ngô Đình Bính (2004), “ Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở Việt Nam”, Báo cáo khoa học, nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống định hướng Nông lâm nghệp miền núi, Thái Nguyên 2004, NXB KHKT, tr. 59 – 62.
8.
http://www.thainguyen.gov.vn/sites/home/news/GioiThieuChung
22/03/2012
9. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2005), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục.
10.Hoàng Thị Lợi (2003), Giáo trình côn trùng học nông nghiệp tập 2, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr. 122 – 167.
11.La Thị Nga, Nguyễn Minh Dương, Trần Duy Minh, Trương Ba Hùng, Võ Thị
Thứ (2003), “Đa dạng phân tử của Bacillus thuringiensis ở các tỉnh Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ”, Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng,1.
12.Khuất Hữu Thanh (2004), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
13.Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Thúy, Ngô Đình Bính (2005),
Nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Bắc Bộ, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, số 4, tr. 29 – 34.
14.Mai Trường, Nguyễn Hữu Hổ, Lê Đức Tấn, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn
Uyển (1998), “Bước đầu chuyển gen bar, gen gusA và gen cry1Ac vào cây đậu
xanh (Vigana radia L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Hội nghị
toàn quốc lần thứ nhất về công nghệ sinh học cây lúa, Huế, tr. 86-87.
Tài liệu tiếng Anh
15.Abad AR, Duck NB, Feng X, Flannagan RD, Kahn TW, Sims LE (2002) Genes
encoding novel protein with pesticidal activity against coleopterans, United States Patent Appication Publication.
16.Barjac D H (1981), “Identification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis”, pp. 36 – 42
17.Barjac D H and Bonnefoi A (1962), “Essai de classification biochimique et serologique de 24 souches de Bacillus du type B. Bacillus thuringiensis.”
18.Bietlot, H. P., J. P. Shernthaner, R. E. Milne, F. R. Clairmont, R> S. Behella, and Kaplan (1993), "Envidence that the CryIA Crystal protein from Bt is associated with DNA", J. Biol. Chem. 268, pp. 8240-8245.
19. Bravo, A (1997), "Phylogenetic relationship of Bacilluc thuringiensis δ endotoxin family proteins and their funtional domains", J. Bateriol 179, pp. 2793 - 2801
20.Burges H. D (2001), "Bacillus thuringiensis in Pest control", Pesticide Outlook, pp. 90 - 98
21.Cao, J., Tang, J. D., Strizhov, N., Shelton, A. M., Earle, E. D. (1999).
“Transgenic broccoli with high levels of Bacillus thuringiensis Cry1C protein control diamondback moth larvae resistant to Cry1A or Cry1C” Mol. Breed, 5,
