Trực khuẩn ruột già Escherichia coli (Ẹ coli) thuộc họ Enterobacteriacae tộc Escherichae, giống Escherichia colị Trong các vi khuẩn ựường ruột loài Ẹ
coli là phổ biến nhất. Vi khuẩn Ẹ coli còn có tên khác là Bacterium Coli commune Bacillus coli comunis do Theodor phân lập ựược lần ựầu tiên vào năm
1885 từ phân trẻ em (Nguyễn Lân Dũng và sc, 1978).
Về mặt huyết thanh học, người ta chia vi khuẩn Ẹ coli ra thành nhiều
serotype khác nhaụ Cho ựến nay ựã phát hiện ựược 279 serotype trong ựó có 250 serotype có ựộc lực và có vai trò quan trọng trong một số bệnh ở gia súc và gia cầm.
2.4.1. đặc ựiểm hình thái
Ẹ coli là trực khuẩn ngắn hai ựầu tròn có kắch thước 2 Ờ 3 x 0,6 ộm. Trên
tiêu bản nhuộm Gram âm vi khuẩn bắt màu Gram âm ựứng riêng rẽ thành từng ựám ựôi khi xếp 2-3 vi khuẩn thành một chuỗi dàị Vi khuẩn không có giáp mô không sinh nha bào và không bắt màu với các nhuộm axit. Vi khuẩn có lông và có khả năng di ựộng (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001). Khi quan sát dưới kắnh hiển vi ựiện tử một số chủng vi khuẩn nhất ựịnh có mang cấu trúc fimbirae hay còn gọi là yếu tố bám dắnh của vi khuẩn Ẹ coli.
2.4.2. đặc tắnh nuôi cấy
Ẹ coli là trực khuẩn hiếu khắ hoặc yếm khắ tùy tiện, chúng có thể phát
triển ựược ở nhiệt ựộ từ 5-40ồC và pH từ 5,5-8,0. Tuy nhiên nhiệt ựộ và pH thắch hợp là 37ồC và pH từ 7,2-7,4, (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001).
Vi khuẩn Ẹ coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông
thường một số chủng có thể phát triển ựược ở môi trường tổng hợp ựơn giản. - Trên môi trường thạch thường: nuôi cấy trực khuẩn Ẹ coli ở 37oC trong
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 17 24 giờ hình thành khuẩn lạc tròn ướt bóng láng không trong suốt màu tro nhạt hơi lồi ựường kắnh 2 - 3 mm. Nuôi lâu khuẩn lạc chuyển màu gần như nâu nhạt và mọc rộng ra có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng nhày (M - Mucous) và dạng nhám (R - Rough).
- Trong môi trường nước thịt: sau khi nuôi cấy 37oC trong 24 giờ trực khuẩn Ẹ coli phát triển rất nhanh môi trường rất ựục có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống ựáy ựôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường môi trường có mùi phân thốị
- Trên môi trường thạch peptone: sau 18 - 24 giờ bồi dưỡng trong tủ ấm vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn ướt màu xám kắch thước trung bình mặt khuẩn lạc hơi lồi lên có nếp nhăn và bề mặt láng bóng.
- Trên môi trường thạch máu: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC hình thành khuẩn lạc to ướt lồi viền không gọn màu sáng kắch thước từ 1 - 2mm có khi gây dung huyết.
- Trên môi trường thạch Mac Conkey: sau khi nuôi cấy 24 giờ bồi dưỡng
tủ ấm 37oC hình thành khuẩn lạc màu ựỏ cánh sen tròn nhỏ hơi lồi không nhày rìa gọn không làm chuyển màu môi trường.
- Trên môi trường Endo: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu ựỏ mận chắn có ánh kim hoặc không.
- Trên môi trường EMB (Eosin Methyl Blue): hình thành khuẩn lạc màu tắm ựen có ánh kim.
- Trên môi trường thạch SS (Salmonella Shigella): vi khuẩn Ẹ coli hình thành khuẩn lạc màu ựỏ.
- Trên môi trường thạch Brilliant green: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC hình thành khuẩn lạc màu vàng chanh.
Không mọc trên các môi trường Malasit và Mulerkauffmann. Bị kiềm chế khi nuôi trong các môi trường Wilson Blair.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 18
2.4.3. đặc tắnh sinh hoá
Nhóm Escherichia gồm những trực khuẩn có khả năng lên men sinh hơi các loại ựường glucose, fructose, galactose, lactose, manitol, mannit, levulose, xylosẹ Lên men không chắc chắn với các loại ựường duncitol, saccarose, salixin. Vi khuẩn Ẹ coli lên men sinh hơi nhanh ựường lactose còn vi khuẩn
Salmonella spp thì không có ựặc tắnh này ựây là ựặc ựiểm quan trọng ựể phân
biệt Ẹ coli và Salmonella spp.
Các phản ứng khác: ựông sữa sau 24 giờ ựến 72 giờ ở 37oC nhưng không làm tan chảy geltatin. Các phản ứng sinh: Indol, catalase và MR dương tắnh, nhưng âm tắnh với các phản ứng sinh Oxidaza, VP, Ureaza và H2S.
Vi khuẩn Ẹ coli có khả năng khử nitrat thành nitrit khử cacboxyl trong
môi trường lysine decacboxylasẹ
2.4.4. Sức ựề kháng
Ẹ coli có sức ựề kháng yếu bị diệt ở nhiệt ựộ 55oC trong 1 giờ hoặc 60oC trong 15- 30 phút ựun sôi 100oC thì chết ngaỵ Các chất sát trùng: axit phênic 3% HgCl2 0,5% Fomol 1 - 2% có thể tiêu diệt vi khuẩn trong 5 phút.
Trong phân và chất ựộn chuồng ẩm ướt thiếu ánh sáng mặt trời Ẹ coli có thể tồn tại trên hai tháng. Vi khuẩn này cũng có khả năng ựề kháng khá tốt với sự sấy khô và hun khóị Các chủng Ẹ coli thường có sức ựề kháng với nhiệt cao so với các chủng Ẹ coli phân lập ựược từ môi trường bên ngoàị Do vậy, các
chủng Ẹ coli gây bệnh có thể tồn tại trong môi trường tới 4 tháng, (Nguyễn
Vĩnh Phước, 1978).
2.4.5. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Ẹ coli
2.4.5.1. Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân O Ờ Somatic antigen)
Kháng nguyên O của vi khuẩn Ẹ coli ựược cấu trúc bởi hợp chất
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 19 chuột nhắt trắng sau 24 giờ. Kháng nguyên O có khả năng chịu ựược nhiệt các chất cồn và axit HCl nồng ựộ 1N.
Cấu trúc phân tử lipopolysaccharide của kháng nguyên O gồm 2 phần: phần polysaccharide nằm ngoài có nhóm hydro mang chức năng tạo ra tắnh ựặc trưng về serotype và phần polysaccharide ở bên trong không có nhóm hydro có chức năng phân biệt giữa các dạng khuẩn lạc. Khi làm mất dần từng ựơn vị ựường của các chuỗi polysaccharide hoặc làm thay ựổi vị trắ các ựơn vị này sẽ dẫn ựến thay ựổi ựộc lực của vi khuẩn. Thành phần lipit trong kháng nguyên có tác dụng quyết ựịnh ựộc tắnh của vi khuẩn Ẹ colị
Kháng nguyên O ựược cấu trúc bởi các phân tử lớn với thành phần các phân tử gồm: Protein: làm cho phức hợp có tắnh kháng nguyên, polyosit: tạo ra tắnh ựặc hiệu của kháng nguyên và lipit: kết hợp với polyosit và là cơ sở của ựộc tắnh.
Bằng phản ứng ngưng kết các nhà khoa học ựã tìm ựược 250 serotype Ọ Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết gọi là "hiện tượng ngưng kết O". Ngưng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt khô rất khó tan khi lắc. Trong ựó các serotyp O1, O2, O78 có trong phần lớn các nhóm Ẹ coli từ gia cầm bệnh (Francis Dziva và cs, 2008
;Mellata và cs, 2003b; Masanori và cs, 2006). Một số công trình nghiên cứu khác cũng ựã xác ựịnh ựược bốn nhóm O2, O5, O8 và O18 có tần xuất trong các mẫu từ gà khỏe (Jesus và cs, 1997; La Ragione và Woodward, 2002; Barnas và cs, 2003.
2.4.5.2. Kháng nguyên H (Kháng nguyên lông Ờ Flagella antigen)
Kháng nguyên H ựược cấu tạo bởi thành phần lông của vi khuẩn có bản chất là protein giống như chất myosin của cơ và mang các ựặc tắnh: Bị phá huỷ ở 60oC trong 1 giờ; Bị phá huỷ bởi cồn 50% và các enzym phân giải protein;
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 20 Kháng nguyên H vẫn tồn tại khi xử lý bằng formol 0,5%. Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết trong ựó các vi khuẩn ựược ngưng kết lại với nhau nhờ lông dắnh lông. Các kháng thể kháng H cố ựịnh trên lông và là cầu nối với các lông bên cạnh. Kết quả tạo nên những hạt ngưng kết giống như những cục bông nhỏ. Các hạt ngưng kết rất dễ tan khi lắc vì lông rất nhỏ và dài dễ ựứt. Các vi khuẩn di ựộng khi cho tiếp xúc với kháng thể tương ứng sẽ trở thành không di ựộng.
Kháng nguyên H bảo vệ vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt trong tế bào ựại thực bào giúp vi khuẩn sống lâu hơn trong tế bào ựại thực bàọ Tuy nhiên ựây không phải là yếu tố ựộc lực và không có vai trò trong ựáp ứng miễn dịch nên ắt ựược quan tâm nghiên cứụ
2.4.5.3. Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ bọc Ờ Capsular antigen)
Kháng nguyên K còn gọi là kháng nguyên bề mặt (Outer membrane protein) chúng bao quanh tế bào vi khuẩn và có bản chất hoá học là polysaccharidẹ Một số nhà nghiên cứu cho rằng kháng nguyên K không có ý nghĩa về ựộc lực (Pourbakh và cs, 1997; McPeake và cs, 2005. Bên cạnh ựó có công trình nghiên cứu chứng minh kháng nguyên K có ý nghĩa về ựộc lực vì chúng tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật chủ. Kháng nguyên K có tác dụng chống lại sự thực bào gồm cả kháng bổ thể trong huyết thanh. Vỏ bọc K1 là polysaccharide có liên quan tới nhiễm trùng ngoài ruột. Kháng nguyên K1 ựược xác ựịnh là yếu tố ựộc lực quan trọng ựối với các chủng serotyp O2:K1 (La Ragione và Woodward 2002). Phần lớn các ý kiến cho rằng kháng nguyên K có 2 nhiệm vụ chắnh:
Hỗ trợ phản ứng ngưng kết với kháng nguyên O của vi khuẩn nên công thức kháng nguyên thường ựược ghi liền là OxK y vắ dụ như Ẹ coli O139:K88.
Tạo ra hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác ựộng ngoại lai và hiện tượng thực bào yếu tố phòng vệ của vật chủ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 21
2.4.5.4. Kháng nguyên F (Kháng nguyên bám dắnh Ờ Fimbriae)
Hầu hết các chủng Ẹ coli gây bệnh ựều có khả năng sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dắnh. Các chủng không gây bệnh thì không có khả năng bám dắnh (Cater và cs, 1995). Kháng nguyên bám dắnh giúp vi khuẩn Ẹ coli có thể bám vào các thụ thể ựặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và lớp
màng nhày chống lại khả năng ựào thải của vi khuẩn do nhu ựộng của ruột. Kháng nguyên bám dắnh của vi khuẩn Ẹ coli chắnh là các cấu trúc Pili (hay còn gọi là Fimbriae) có cấu trúc giống sợi lông ngắn thẳng xuất phát từ một ựĩa gốc trong màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn. Fimbriae có bản chất là protein bao phủ trên bề mặt ngoài của tế bào với số lượng từ 10-400/tế bào vi khuẩn. Fimbriae của vi khuẩn Ẹ coli khác lông ở chỗ: cứng hơn không lượn
sóng và không liên quan ựến khả năng di ựộng. Kháng nguyên bám dắnh ựược phân loại bằng các phản ứng huyết thanh học các thụ thể ựặc hiệu hoặc khả năng ngưng kết hồng cầu với các loại ựộng vật khác nhau (Cater1995).
Một số yếu tố bám dắnh quan trọng thường gặp trong các chủng APEC bao gồm: Fimbriae F1 (có khả năng mẫn cảm cao với ựường D- Mannose Ờ MSHA) Fimbriae P (ựặc trưng cho nhóm chắnh kháng D- Mannose- MRHA) (Delicato và cs, 2003).
2.5.6. Các yếu tố ựộc lực quan trọng và ựặc tắnh gây bệnh của vi khuẩn Ẹ coli gây bệnh ở gia cầm coli gây bệnh ở gia cầm
đặc tắnh gây bệnh của Ẹ coli là nhờ các yếu tố ựộc lực gồm: Khả năng bám dắnh của vi khuẩn vào lớp niêm mạc nhờ các fimbriae; khả năng xâm nhập nhờ các yếu tố xâm nhập (như khả năng kháng bổ thể trong huyết thanh khả năng tồn tại và phát triển của vi khuẩn trong môi trường sinh lý của vật chủ nhờ hệ thống thu nhận cạnh tranh sắt) khả năng sản sinh các tác ựộng gây ựộc tế bào (Dho-Moulin và Fairbrother, 1999).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 22
2.5.6.1. Yếu tố bám dắnh (Fimbriae)
Yếu tố bám dắnh của vi khuẩn Ẹ coli ựược ựịnh vị trên các fimbriaeựó là những chuỗi protein mạch thẳng tập hợp từ những ựơn vị ựộc lập có thể quan sát dưới kắnh hiển vi ựiện tử. Tổng số các ựơn vị này trên chuỗi protein quyết ựịnh trọng lượng phân tử và ựộ dài của yếu tố bám dắnh. Lực tham gia liên kết các ựơn vị này thành chuỗi protein cho ựến nay vẫn chưa ựược làm sáng tỏ tuy nhiên những liên kết này có thể bị tách ra trong môi trường có Na2SO4 (Isaacson và cs 1981). Trong một số trường hợp do sự tác ựộng nhanh của môi trường axit các ựơn vị ựó liên kết với nhau bởi các mối liên kết hydro và các mối liên kết ion (Isaacson và cs 1981). Các ựơn vị protein của fimbriae ựược tổng hợp phần lớn từ các amino axit và các hợp chất không phải là amino axit như photphat hoặc photpholipit. Các hợp chất không phải amino axit này có thể tham gia vào các liên kết bên trong các ựơn vị hoặc chỉ tạo nên những ựiểm làm chức năng liên kết ở vỏ bọc bên ngoài có tắnh chất quyết ựịnh ựối với chức năng bám dắnh. Trọng lượng phân tử của mỗi ựơn vị bám dắnh từ 80000 ựến 26000 dalton.
Cấu trúc của các fimbriae phần lớn ựược cấu tạo bởi các axit amin không phân cực (chiếm khoảng 50%) trong số các axit amin. Các nhà khoa học ựã chứng minh ựược fimbriae của Ẹ coli tạo liên kết hydro vững chắc hơn nhiều so với Ẹ coli không có fimbriae ựồng thời tìm ra ựộ dài tổng số của cấu trúc thẳng của polyprotein fimbriae mối liên quan của chúng ựối với ựường D- Mannose cũng như khả năng ngăn cản sự bám dắnh của các loại vi khuẩn này nên trên tế bào hình cầu chuột lang khi có mặt của ựường D- MannosẹTừ ựó ựã ựưa ra những nhận xét sau:
+ Vị trắ liên kết dành cho fimbriae của Ẹ coli ựược tìm thấy trong dạng cấu trúc hình oval.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 23 sẽ phá vỡ hay ngăn cản sự ngưng kết của hồng cầu với các yếu tố bám dắnh của vi khuẩn Ẹ coli do ựiểm tiếp nhận của yếu tố bám dắnh cũng có bản chất là Mannose (Mannosides).
+ Vị trắ liên kết dành cho fimbriae của vi khuẩn Ẹ coli là tương tự như vị trắ dành cho liên kết của vi khuẩn Klebsiella pneumoniae nhưng khác với vị trắ liên kết dành cho fimbriae của vi khuẩn Salmonella typhymurium.
+ Ba yếu tố tạo nên sự bám dắnh ựược sắp xếp bởi các hợp chất cấu trúc nên các ựơn vị Nitơ Ờ Glucozit và các ựơn vị này có mặt trên bề mặt của tế bào ruột non.
Khả năng bám dắnh của vi khuẩn là yếu tố gây bệnh vô cùng quan trọng ựể thực hiện bước ựầu tiên của quá trình gây bệnh của vi khuẩn ựường ruột. đó là quá trình liên kết vững chắc thuận nghịch giữa bề mặt vi khuẩn với tế bào vật chủ (Jones, 1977). Hiện tượng bám dắnh của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tắnh chất lý hóa học vừa mang tắnh chất sinh học và ựược thực hiện theo ba bước sau:
+ Bước 1: Vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào thực hiện quá trình này ựòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di ựộng (Jones, 1981) .
+ Bước 2: Quá trình hấp thụ nó phụ thuộc vào ựặc tắnh bề mặt của vi khuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dắnh và thực hiện theo hướng thuận nghịch dưới sự tác ựộng của những lực tương hỗ lẫn nhau (Freter, 1976). Việc chuyển ựộng thẳng tiến của cũng có thể giúp vi khuẩn cố ựịnh và bám chắc lên bề mặt tế bào tham gia vào sự hấp thụ của quá trình bám dắnh (Nguyễn Thị Nội, 1996).
+ Bước 3: Quá trình tác ựộng tương tác giữa yếu tố bám dắnh của vi khuẩn với các ựiểm tiếp nhận trên bề mặt tế bàọ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 24 Khả năng xâm nhập của vi khuẩn là khả năng của vi khuẩn Ẹ coli qua ựược hàng rào bảo vệ của lớp màng nhày trên bề mặt niêm mạc ựể xâm nhập vào tế bào biểu mô (epitel) hoặc vào máu từ ựó sản sinh và phát triển trong khi ựó những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập thì sẽ không thể qua