- Phương pháp lấy mẫu dịch ngoáy trực tràng
Dùng bông tăm vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng gà Lôi trắng cần kiểm tra (1-3cm, tùy theo từng ựộ tuổi của gà) sau ựó cho vào ống TRANSPORT SWAB chuyên dụng ựắnh kèm, ghi nhãn bảo quản trong hộp ựá rồi vận chuyển về phòng thắ nghiệm.
được tiến hành dựa theo phương pháp thường quy tại Bộ môn Vi trùng Ờ Viện Thú ỵ Mỗi mẫu bệnh phẩm ựược cấy lặp lại 3 lần lấy kết quả trung bình. Quy trình thực hiện như Hình 3.1.
Cấy 0,2 ml huyễn dịch phân bệnh phẩm trên thạch Istratị Sau khi cấy và bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ kiểm tra khuẩn lạc Ẹ coli. Chọn khuẩn lạc dạng S có màu vàng ựặc trưng trên môi trường thạch Istrati cấy sang môi trường MacConkey và môi trường Brilliant green agar bồi dưỡng ở 37o C trong 24 giờ lấy ra quan sát tắnh chất mọc màu sắc khuẩn lạc ựộ tinh khiết. Nếu thuần khiết cấy giữ giống trên thạch máu ựể tiến hành kiểm tra hình thái và giám ựịnh các
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
3.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Ẹ colị
Tắnh chất sinh học
Nhuộm Gram và kiểm tra hình thái Thử phản ứng sinh hóa, ựộc lực Giữ trên thạch máu
Phân hoặc bệnh phẩm của gà lôi trắng nghi mắc bệnh
Istrati
(Khuẩn lạc thuần khiết dạng S màu vàng)
Mac Conkey (Khuẩn lạc màu ựỏ)
Khuẩn lạc thuần khiết Brilliant green agar
(Khuẩn lạc màu vàng chanh)
Chọn chủng và giữ giống vi khuẩn trong môi trường BHI/Glycerin (-200C)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
Hình 3.1: Sơ ựồ phân lập và giám ựịnh Ẹ coli từ phân
3.5.3. Phương pháp xác ựịnh vi khuẩn Ẹ coli phân lập ựược.
3.5.3.1.Kiểm tra hình tháị
Từ giống phân lập giữ trên thạch máu cấy chuyển ra nước thịt hoặc thạch nghiêng làm tiêu bản nhuộm Gram ựể kiểm trạ Vi khuẩn Ẹ coli sẽ bắt màu ựỏ (Gram âm).
3.5.3.2. Kiểm tra khả năng di ựộng.
- Kiểm tra khả năng di ựộng bằng phương pháp cấy chắch sâu vi khuẩn vào thạch mềm.
- Phương pháp làm: dùng que cấy ựầu nhọn vô trùng lấy vi khuẩn cấy chắch sâu vào giữa ống thạch mềm ựến gần ựáy thì rút rạ để ống nuôi cấy trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
- Kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng di ựộng thì dọc theo ựường cấy vi khuẩn mọc lan rạ
3.5.3.3. Kiểm tra tắnh chất mọc.
- Nuôi cấy vi khuẩn trên các môi trường: nước thịt thạch thường thạch máu các môi trường ựặc biệt như: Istrati, MacConkey, thạch Brilliant green, nước thịt gan yếm khắ, thạch máu yếm khắ. Quan sát tắnh chất mọc hình thái kắch thước và mầu sắc khuẩn lạc.
3.5.3.4. Giám ựịnh các ựặc tắnh sinh hóạ - Khả năng lên men các loại ựường:
Trong môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth bổ sung thêm 1,5 ml xanh Bromothymol 1,5% trong cồn và các loại dung dịch ựường cần kiểm tra cấy vi khuẩn vào bồi dưỡng trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ ựọc kết quả. Phản ứng dương tắnh khi môi trường chuyển màu hồng, và ngược lại nếu âm tắnh môi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40 trường vẫn giữ nguyên màu sắc ban ựầụ
- Phản ứng sinh Indol:
Nhỏ thuốc thử Kowacs vào môi trường Peptol ựã nuôi cấy vi khuẩn. Phản ứng dương tắnh khi có một vòng tròn ựỏ xuất hiện trên mặt môi trường. Phản ứng âm tắnh khi không có vòng ựỏ trên bề mặt môi trường. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phản ứng Oxidaza:
+ được làm trên giấy có tẩm dung dịch 1% Tetramethuyl Ờ P.pheny diamine hydrochloridẹ
+ Phương pháp làm: Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ môi trường thạch chà sát lên mặt giấy ựã thấm thuốc thử. Nếu chỗ chà sát sau 30 giây xuất hiện màu tắm ựen là phản ứng dương tắnh. Nếu không xuất hiện màu tắm ựen hoặc không ựổi màu là phản ứng âm tắnh.
- Phản ứng catalaza:
Phương pháp làm: Lấy một phiến kắnh sạch dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch ựặt lên phiến kắnh sạch nhỏ 1 giọt dung dịch H2O2 3% (hydrogen peroxidaza). Nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tắnh nếu không thấy sủi bọt là phản ứng âm tắnh.
- Phản ứng thử V.P. (Voges Proskauer):
Cấy vi khuẩn vào môi trường Peptol glucoza 37oC trong 2-4 ngày sau ựó nhỏ thuốc thử (NaOH 40g/100ml nước cất hoặc dung dịch pootat) sau 5 phút nếu có màu ựỏ hồng là dương tắnh có thể phản ứng sau 4-5 giờ mới xuất hiện.
- Phản ứng thử M.R (Methuyl Rouge):
Cấy vi khuẩn vào môi trường Peptol glucoza 37oC trong vòng 2-4 ngày sau ựó nhỏ 2-3 giọt dung dịch ựỏ methyl 0.04% trong cồn 95o vào sau 5 phút nếu có màu ựỏ là phản ứng dương tắnh màu vàng là âm tắnh giữa màu ựỏ và màu vàng là phản ứng nghi ngờ.
3.5.4. Phương pháp xác ựịnh một số yếu tố có liên quan ựến ựộc lực của vi khuẩn Ẹ coli khuẩn Ẹ coli
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
3.5.4.1. Phản ứng ngưng kết hồng cầu ựể xác ựịnh F1 Fimbriae
- Nguyên lý: F1 Fimbriae của Ẹ coli có ựặc tắnh rất nhạy với sự có mặt của ựường D-Mannose và gây kết dắnh hồng cầu của một số loài ựộng vật như chuột lang, bò, cừu gà và ngườị
- Phương pháp: ựược tiến hành như mô tả của Jone & Rutter (1974) với một số cải tiến:
+ Chuẩn bị hồng cầu: (Red Blood Cell Ờ RBC): máu bò ựực hoặc của cừu, gà ựược lấy tươi trong 3,8% dung dịch Sodium citrat. Máu ựược ly tâm trong vòng (2500vòng/phút trong 10 phút) rửa 3 lần với thể tắch PBS gấp 10 lần (PH=7,2) (PBS hoặc với 2,5% D- mannose ựể ựược dung dịch hồng cầu 3%. Hồng cầu sau ựó ựược dùng ngay hoặc giữ trong tủ lạnh 40C trong 1-2 ngàỵ
+ Chuẩn bị vi khuẩn: Chủng vi khuẩn kiểm tra ựược nuôi cấy trong môi trường BHI bồi dưỡng ở tủ ấm 370C trong 72 giờ không lắc. Lặp lại qui trình nuôi cấy này từ 4-6 lần. Canh khuẩn sau ựó ựược ly tâm 3500 vòng /phút trong 15 phút và pha loãng trong PBS (PH= 7,2) ựể ựược nồng ựộ cuối cùng khoảng 1010 vi khuẩn/ml.
+ Phản ứng: ựược thực hiện trong ựĩa nhựa 96 lỗ, ựáy tròn với một lượng tương ựương hồng cầu và huyễn dịch vi khuẩn (50ộl). Từ nồng ựộ nguyên ban ựầu tiến hành pha loãng huyễn dịch vi khuẩn theo cơ chế 2 (log2) trong dung dịch PBS (PH=7,2) sau ựó cho vào mỗi giếng 50ộl 3% RBC hoặc 3% RBC + Mannose ủ ở 40C trong 2giờ.
+ đọc kết quả: Phản ứng dương tắnh, có biểu hiện ngưng kết lấm tấm ở ựáy giếng. Phản ứng âm tắnh, hồng cầu lắng thành một lớp ựều ở ựáy giếng.
3.5.4.2. Phương pháp PCR ựể xác ựịnh một số yếu tố ựộc lực cơ bản của vi khuẩn Ẹ coli
- Các bước tiến hành:
+ DNA mẫu: Khuẩn lạc vi khuẩn Ẹ coli mọc trên môi trường thạch máu ở 37oC trong 24 giờ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42 Primers : 1ộl mỗi loại
Dung dịch ựệm (5X) : 5.0ộl Enzyme (Taq polymerase): 0.05ộl
Nước khử ion vừa ựủ ựể ựạt ựược thể tắch cuối cùng là 25ộl/ phản ứng. + Chu trình phản ứng PCR:
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhaụ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và thực hiện trong máy nhân gen tự ựộng (Parkin Elmer) theo Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khái quát qui trình xác ựịnh một số yếu tố ựộc lực của Ẹ coli
Chu trình
thứ 1 30 chu trình tiếp theo
Chu trình cuối Loại yếu tố gây bệnh cần xác ựịnh Biến tắnh (oC/ phút) Biến tắnh (oC/ phút) Gắn mồi (oC/ phút) Tổng hợp (oC/ phút) Tổng hợp (oC/ phút) STa STb LT 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 F1 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7
+ Chạy ựiện di: Sản phẩm PCR thu ựược sau chu trình phản ứng ựược nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) ựược trộn với mẫu theo tỷ lệ 1:5. Sau khi nhuômsản phẩm PCR ựược chạy ựiện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch ựệm TAE (Tris Ờ Acetic Ờ EDTA) với hiệu ựiện thế 100V trong vòng 40 phút. đây là cách làm cho các ựoạn acid nucleic hiện thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các acid nucleic trong môi trường pH trung tắnh thì tắch ựiện âm nhờ nhóm photphat nằm trên khung phosphodiesrer của các sợi nucleic. Khi ựặt chúng vào ựiện trường các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tắch trên thạch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43 agarose các phân tử acid nucleic tùy theo kắch thước sẽ chuyển dịch với tốc ựộ khác nhau: Loại phân tử có kắch thước lớn chạy chậm loại có kắch thước bé sẽ chuyển dịch nhanh hơn.
+ Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy ựiện di ựược nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (bet 1ộl/ml) trong vòng 15 phút. Bet là loại chất nhuộm màu huỳnh quangphân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazọ Vị trắ cố ựịnh của các nhóm có khoảng cách gần với bazo tạo ra 1 lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử Bet tự dọ
+ đọc kết quả: Bằng cách quan sát dưới ánh ựèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trên ảnh chụp nền ựen các ựoạn acid nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh ựược và ghi nhận lạị Kắch thước các dải băng DNA ựược so sánh với DNA chuẩn ựược cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác ựịnh ựược ựộ dài các ựoạn sản phẩm PCR.
3.5.5. Kiểm tra ựộc lực của các chủng vi khuẩn Ẹ coli phân lập ựược trên chuột bạch. chuột bạch.
để xác ựịnh ựộc lực của vi khuẩn gây bệnh có thể thực hiện bằng phương pháp tiêm truyền qua ựộc vật thắ nghiệm, theo phương pháp của Carter (1984) theo các bước:
Bước 1: Các vi khuẩn thuần khiết từ môi trường giữ giống ựược cấy chuyển vào môi trường nước thịt BHI trong bình tam giác 100ml. Canh trùng ựược bồi dưỡng ở 37oC/24 giờ. Trong quá trình nuôi lắc ựảo ựể kắch thắch sự tăng sinh của vi khuẩn. Xác ựịnh số lượng vi khuẩn trong 1 ml canh trùng bằng phương pháp ựếm số lượng khuẩn lạc trên thạch.
Bước 2: Tiêm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu cho 2 chuột nhắt trắng khỏe mạnh (Có trọng lượng từ 20 Ờ 25g/con) với liều tiêm là 0,2ml/con vào xoang phúc mạc.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44 Bước 3: Kiểm tra và theo dõi thời gian chết số lượng chuột chết mỗi ngày 2 lần (sáng từ 6-7 giờ và chiều từ 16-17giờ). Căn cứ vào số lượng chuột chết giờ chuột chết bình quân của mỗi lô ựể ựánh giá ựộc lực của vi khuẩn. Mổ khám phân lập vi khuẩn từ máu tim chuột chết.
3.5.6. Xác ựịnh serotype kháng nguyên O của chủng vi khuẩn Ẹ coli phân lập bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh. lập bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh.
Vi khuẩn Ẹ coli có nhiều serotype O khác nhaụ Do vậy, bước quan trọng ựầu tiên là xác ựịnh ựược nhóm serotype O sau ựó tiến hành phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh ựơn giá trong nhóm cần xác ựịnh.
- Chuẩn bị:
+ Chủng vi khuẩn Ẹ coli cần xác ựịnh serotype ựược cấy trên thạch máu cừu ủ ở tủ ấm 370C trong 18-24 giờ.
+ Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và ựơn giá) + Nước muối sinh lý 0,9% phiến kắnh sạch que cấy nhựạ - Phương pháp tiến hành:
Nhỏ lên 2 ựầu lam kắnh sạch mỗi ựầu 1 giọt nước muối sinh lý dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc Ẹ coli cần xác ựịnh trên môi trường thạch máu trộn ựều với 2 giọt nước muối sinh lý thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh chuẩn vào 1 bên huyễn dịch 1 giọt nước muối sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (ựối chứng):
+ Phản ứng dương tắnh khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh sẽ xuất hiện trong vòng 30 giây tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm huyễn dịch tách làm hai phần là các hạt ngưng kết và phần nước lỏng. Với phản ứng ngưng kết xảy ra rất nhanh rõ rệt thì ựánh giá ở mức + + + +. Tùy theo khả năng ngưng kết ựể có thể ựánh giá mức ngưng kết ở mức ựộ khác nhau: ++ ++ + +.
+ Phản ứng âm tắnh là khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh ựục ựều giống như ựối chứng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 45 - Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh ựa giá thì tiếp tục thực hiện như vậy với kháng huyết thanh ựơn giá thuộc nhóm ựể xác ựịnh rõ từng serotypẹ Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hay ngưng kết với nhiều ựơn giá khác nhau thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2 kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất.
3.5.7. Phương pháp xác ựịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn Ẹ coli phân lập ựược.
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập ựược kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên ựĩa thạch và ựánh giá kết quả theo hội ựồng quốc gia Hoa kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thắ nghiệm (NCCLS, 2010).
Bảng 3.2. Tiêu chuẩn ựánh giá mức ựộ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo NCCLS (2010)
đường kắnh vòng vô khuẩn (mm) TT Thuốc kháng sinh Hàm lượng thuốc (ộg) Kháng Mẫn cảm trung bình Mẫn cảm 1 Ampicillin (Am) 10 ≤ 13 14 ọ 16 ≥ 17 2 Kanamicin (Km) 30 ≤ 13 14 ọ 17 ≥ 18 3 Streptomycin (Sm) 10 ≤ 11 12 ọ 14 ≥ 15 4 Sulfisoxazole (Su) 250 ≤ 10 11 ọ 16 ≥ 17 5 Tetracycline (Tc) 30 ≤ 11 12 ọ 14 ≥ 15 6 Gentamycin (Gm) 10 ≤ 12 13 ọ 14 ≥ 15 7 CiprOfloxacin (Cip) 5 ≤ 15 16 ọ 20 ≥ 21 8 Ofloxacin (Ofx) 5 ≤ 12 13 ọ 15 ≥ 16
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 46 9 Cephalothin (Cf) 30 ≤ 14 14 ọ 17 ≥ 18
10 Neomycin 30 ≤ 14 14 ọ 17 ≥ 18
11 Colistin (Col) 10 ≤ 10 - ≥ 11
-Phương pháp tiến hành như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch ựĩa Muller Hinton
+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn ựược nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 370C /24 h. Lấy ơ khuẩn lạc hòa vào 1,5ml nước sinh lý ựể ựạt ựược ựộ ựục 0,5 trong dãy so màu McFarlDNẠ Dùng bông tăm vô trùng tẩm dung dịch ựã pha loãng và dàn ựều trên thạch ựĩa Muller Hinton.
+ Bước 3: Dùng máy tự ựộng ựặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt ựĩa thạch.
+ Bước 4: Nuôi vi khuẩn ở 37ồC/18-24 giờ. đọc kết quả bằng cách ựo ựường kắnh vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn ựể ựánh giá mức ựộ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra (Bảng 3.1)
3.5.8. Thử nghiệm một số phác ựồ trị bệnh tiêu chảy do Ẹ coli gây ra ở gà Lôi trắng gà Lôi trắng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chúng tôi tiến hành thử nghiệm một số phác ựồ ựiều trị cho gà Lôi trắng bị tiêu chảy do Ẹ coli gây ra theo phương pháp phân lô so sánh. Mỗi phác ựồ ựiều trị ựều ựược sử dụng cho số gà bệnh tương ựương nhau ở mọi lứa tuổi, và có cùng loại thức ăn, nước uống cũng như chế ựộ chăm sóc, nuôi dưỡng. Mỗi lô dùng một loại kháng sinh khác nhau căn cứ theo kết quả làm kháng sinh ựồ với các chủng Ẹ coli phân lập ựược từ gà bị tiêu chảỵ Ngoài ra, các loại thuốc bổ trợ ựều ựược sử dụng tương tự nhau ở các phác ựồ với liều lượng như trình bày ở bảng 3.3. Các loại thuốc ựều ựược sử dụng theo cách pha vào nước uống cho gà bệnh. đây là cách làm phù hợp nhất với ựặc ựiểm sinh lý của gà lôi, vì bản
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 47