lập bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh.
Vi khuẩn Ẹ coli có nhiều serotype O khác nhaụ Do vậy, bước quan trọng ựầu tiên là xác ựịnh ựược nhóm serotype O sau ựó tiến hành phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh ựơn giá trong nhóm cần xác ựịnh.
- Chuẩn bị:
+ Chủng vi khuẩn Ẹ coli cần xác ựịnh serotype ựược cấy trên thạch máu cừu ủ ở tủ ấm 370C trong 18-24 giờ.
+ Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và ựơn giá) + Nước muối sinh lý 0,9% phiến kắnh sạch que cấy nhựạ - Phương pháp tiến hành:
Nhỏ lên 2 ựầu lam kắnh sạch mỗi ựầu 1 giọt nước muối sinh lý dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc Ẹ coli cần xác ựịnh trên môi trường thạch máu trộn ựều với 2 giọt nước muối sinh lý thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh chuẩn vào 1 bên huyễn dịch 1 giọt nước muối sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (ựối chứng):
+ Phản ứng dương tắnh khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh sẽ xuất hiện trong vòng 30 giây tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm huyễn dịch tách làm hai phần là các hạt ngưng kết và phần nước lỏng. Với phản ứng ngưng kết xảy ra rất nhanh rõ rệt thì ựánh giá ở mức + + + +. Tùy theo khả năng ngưng kết ựể có thể ựánh giá mức ngưng kết ở mức ựộ khác nhau: ++ ++ + +.
+ Phản ứng âm tắnh là khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh ựục ựều giống như ựối chứng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 45 - Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh ựa giá thì tiếp tục thực hiện như vậy với kháng huyết thanh ựơn giá thuộc nhóm ựể xác ựịnh rõ từng serotypẹ Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hay ngưng kết với nhiều ựơn giá khác nhau thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2 kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất.
3.5.7. Phương pháp xác ựịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn Ẹ coli phân lập ựược.
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập ựược kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên ựĩa thạch và ựánh giá kết quả theo hội ựồng quốc gia Hoa kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thắ nghiệm (NCCLS, 2010).
Bảng 3.2. Tiêu chuẩn ựánh giá mức ựộ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo NCCLS (2010)
đường kắnh vòng vô khuẩn (mm) TT Thuốc kháng sinh Hàm lượng thuốc (ộg) Kháng Mẫn cảm trung bình Mẫn cảm 1 Ampicillin (Am) 10 ≤ 13 14 ọ 16 ≥ 17 2 Kanamicin (Km) 30 ≤ 13 14 ọ 17 ≥ 18 3 Streptomycin (Sm) 10 ≤ 11 12 ọ 14 ≥ 15 4 Sulfisoxazole (Su) 250 ≤ 10 11 ọ 16 ≥ 17 5 Tetracycline (Tc) 30 ≤ 11 12 ọ 14 ≥ 15 6 Gentamycin (Gm) 10 ≤ 12 13 ọ 14 ≥ 15 7 CiprOfloxacin (Cip) 5 ≤ 15 16 ọ 20 ≥ 21 8 Ofloxacin (Ofx) 5 ≤ 12 13 ọ 15 ≥ 16
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 46 9 Cephalothin (Cf) 30 ≤ 14 14 ọ 17 ≥ 18
10 Neomycin 30 ≤ 14 14 ọ 17 ≥ 18
11 Colistin (Col) 10 ≤ 10 - ≥ 11
-Phương pháp tiến hành như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch ựĩa Muller Hinton
+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn ựược nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 370C /24 h. Lấy ơ khuẩn lạc hòa vào 1,5ml nước sinh lý ựể ựạt ựược ựộ ựục 0,5 trong dãy so màu McFarlDNẠ Dùng bông tăm vô trùng tẩm dung dịch ựã pha loãng và dàn ựều trên thạch ựĩa Muller Hinton.
+ Bước 3: Dùng máy tự ựộng ựặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt ựĩa thạch.
+ Bước 4: Nuôi vi khuẩn ở 37ồC/18-24 giờ. đọc kết quả bằng cách ựo ựường kắnh vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn ựể ựánh giá mức ựộ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra (Bảng 3.1)