Vi khuẩn thường sẵn có ở môi trường, khi gia cầm bị stress như thời tiết thay ựổi, vận chuyển hoặc mắc các bệnh khác như CRD, Gumboro ... sức ựề kháng của cơ thể giảm sút Ẹ coli sẽ bùng phát và gây bệnh. Bệnh do Ẹ coli
thường lây truyền chủ yếu qua thức ăn, nước uống bị nhiễm Ẹ coli.
Trir colilây truyền chủ yếu qua thức ăn, nước uống bị nhi, song chy truyền chủ yếỉ song phân loãng có dịó d loãng truyền chủ yếu qua thức ăn, nướ. Nd loãng truyền chủ CRD thì gà bthì ng truyền viêm túi khắ màng tim hay viêm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 phổiêm phm Mổ khám thấy bệnh tắch ắt ựiển hình: gan sưng bầm ựen niêm mạc ruột dày màng túi khắ viêm.
Vấn ựề phòng chống bệnh Ẹ coli gây ra ựã ựang và sẽ vẫn là những vấn ựề nan giải cần ựược giải quyết. Hiện tại có 3 mục tiêu cơ bản ựể phòng:
Hướng thứ nhất là vệ sinh tốt ựể giảm lượng Ẹ coli gây bệnh. động vật sống một thời gian khá lâu trong chuồng trại nên chịu ảnh hưởng lớn của nhiều yếu tố về chuồng trại nhất là ựối với giai ựoạn non và giai ựoạn sinh sản. Các yếu tố từ ựiều kiện môi trường: nhiệt ựộ, ẩm ựộ, ựộ thông thoáng khắ và ựộ chiếu sáng. Và theo nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy phương thức nuôi nhốt có tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn phương thức nuôi bán chăn thả do phương thức nuôi nhốt thường nuôi với mật ựộ cao nên ựộ thông thoáng khắ kém hơn môi trường dễ bị ô nhiễm hơn. điều này có thể cải thiện nhờ vệ sinh các thiết bị dụng cụ chăn nuôi cải tiến chuồng trại cho thông thoáng và tránh ẩm thấp giảm sự lan truyền của Ẹ coli từ ựộng vật nhiễm bệnh giảm sự tiếp xúc của ựộng vật với phân.
Nếu phát hiện ựộng vật tiêu chảy phải ựiều trị nhanh chóng với các thuốc kháng khuẩn có hiệu quả (Theo kiểm tra ở phòng thắ nghiệm hoặc kinh nghiệm ở ựàn) ựể chống lại chủng có trong ựàn. Việc ựiều trị cho con vật bị bệnh cũng là một cố gắng ựể giảm lượng Ẹ coli gây bệnh mà con vật thải ra theo phân.
Hướng thứ hai là tiến hành chăm sóc nuôi dưỡng tốt ựể duy trì sức kháng tự nhiên. Nếu thức ăn nước uống mất vệ sinhbị lên men thối hỏng hoặc lẫn các vật lạ có thể mang mầm bệnh và chất ựộc vào cơ thể con vật. Và khẩu phần thúc ăn không hợp lý sẽ làm khả năng miễn dịch giảm sút rõ rệt. Vì vậytrong quá trình chăm sóc nuôi dưỡng cần phải sử dụng thức ăn thắch hợp theo nhu cầu lứa tuổị
Hướng thứ ba là tạo sức miễn dịch ựặc hiệu bằng cách tiêm chủng vacxin cho con mẹ ựể con con có thể nhận ựược kháng thể ựặc hiệụ Hướng phòng trị này hiện nay ựang ựược nghiên cứu và ứng dụng nhiều hơn cho các loài gia súc.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
PHẦN III
đỐI TƯỢNG, đỊA đIỂM,
NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Gà Lôi trắng nuôi tại vườn Quốc gia Cúc Phương bị mắc tiêu chảy do Ẹ
coli gây rạ
Các chủng Ẹ coli phân lập ựược từ gà Lôi trắng bị mắc tiêu chảy ựang nuôi tại vườn Quốc gia Cúc Phương.
3.2. Địa ựiểm nghiên cứu
- Trung tâm cứu hộ và bảo tồn ựộng vật hoang dã Ờ vườn Quốc gia Cúc Phương - Nho Quan - Ninh Bình.
- Bộ môn Nội - Chẩn - Dược- độc chất - Khoa Thú Y Trường đại học Nông nghiệp Hà Nộị
- Bộ môn vi trùng Viện Thú y Quốc giạ
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Xác ựịnh tình hình mắc tiêu chảy do Ẹ coli gây ra trên ựàn gà Lôi trắng nuôi tại vườn Quốc gia Cúc Phương ở các lứa tuổị
- Xác ựịnh một số ựặc tắnh sinh học của Ẹ coli phân lập ựược từ gà Lôi trắng bị tiêu chảỵ
- Kiểm tra tắnh mẫn cảm của các chủng vi khuẩn Ẹ coli phân lập ựược với một số loại thuốc kháng sinh phù hợp cho việc ựiều trị trên ựàn gà Lôi trắng bị tiêu chảy do Ẹ coli gây rạ
- Xây dựng phác ựồ ựiều trị bệnh viêm ruột tiêu chảy cho ựàn gà Lôi trắng nuôi tại vườn Quốc gia Cúc Phương.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
3.4. Nguyên liệu nghiên cứu
3.4.1. Mẫu bệnh phẩm sử dụng nghiên cứu
- Bệnh phẩm là dịch ngoáy trực tràng của gà Lôi trắng ở mọi lứa tuổi (từ
1-2 tuần ựến trên 12 tháng tuổi) bao gồm cả gà khỏe và gà bị tiêu chảy do nghi mắc Ẹ coli.
3.4.2. Môi trường hóa chất
- Các loại môi trường dùng ựể phân lập vi khuẩn Ẹ coli do hãng Oxoid cung cấp bao gồm:
+ Môi trường phân lập vi khuẩn: Istrati,Thạch máu, MacConkey, EMB (Eosin Methylen Blue), BG (Brilliant Green), môi trường nước thịt thường.
+ Môi trường giám ựịnh vi khuẩn: Thạch Simon Citrat nước thịt trypton môi truờng MR-VP nước thịt pepton.
-Môi trường TSB môi trường BHI dùng ựể bồi dưỡng vi khuẩn Ẹ coli. -Môi trường nước Muller HintonMôi trường thạch Muller Hinton dùng ựể kiểm tra khả năng mẫn cảm của kháng sinh.
-Các loại hóa chất gồm:
+ Thuốc nhuộm Giemsa, Gram dung dịch KvacỖs dung dịch DNAradẹ + Các loại giấy tẩm kháng sinh dùng ựể kiểm tra khả năng mẫn cảm của kháng sinh
-Các loại kháng huyết thanh O chuẩn (ựa giá và ựơn giá) do hãng DenkaSeiken Cọ, Ltd Niigata Nhật cung cấp.
-Các sinh phẩm hóa chất cho phản ứng PCR (chi tiết ựược trình bày cụ thể trong phần phương pháp nghiên cứu).
3.4.3. động vật thắ nghiệm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp lấy mẫu
- Phương pháp lấy mẫu dịch ngoáy trực tràng
Dùng bông tăm vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng gà Lôi trắng cần kiểm tra (1-3cm, tùy theo từng ựộ tuổi của gà) sau ựó cho vào ống TRANSPORT SWAB chuyên dụng ựắnh kèm, ghi nhãn bảo quản trong hộp ựá rồi vận chuyển về phòng thắ nghiệm.
được tiến hành dựa theo phương pháp thường quy tại Bộ môn Vi trùng Ờ Viện Thú ỵ Mỗi mẫu bệnh phẩm ựược cấy lặp lại 3 lần lấy kết quả trung bình. Quy trình thực hiện như Hình 3.1.
Cấy 0,2 ml huyễn dịch phân bệnh phẩm trên thạch Istratị Sau khi cấy và bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ kiểm tra khuẩn lạc Ẹ coli. Chọn khuẩn lạc dạng S có màu vàng ựặc trưng trên môi trường thạch Istrati cấy sang môi trường MacConkey và môi trường Brilliant green agar bồi dưỡng ở 37o C trong 24 giờ lấy ra quan sát tắnh chất mọc màu sắc khuẩn lạc ựộ tinh khiết. Nếu thuần khiết cấy giữ giống trên thạch máu ựể tiến hành kiểm tra hình thái và giám ựịnh các
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
3.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Ẹ colị
Tắnh chất sinh học
Nhuộm Gram và kiểm tra hình thái Thử phản ứng sinh hóa, ựộc lực Giữ trên thạch máu
Phân hoặc bệnh phẩm của gà lôi trắng nghi mắc bệnh
Istrati
(Khuẩn lạc thuần khiết dạng S màu vàng)
Mac Conkey (Khuẩn lạc màu ựỏ)
Khuẩn lạc thuần khiết Brilliant green agar
(Khuẩn lạc màu vàng chanh)
Chọn chủng và giữ giống vi khuẩn trong môi trường BHI/Glycerin (-200C)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
Hình 3.1: Sơ ựồ phân lập và giám ựịnh Ẹ coli từ phân
3.5.3. Phương pháp xác ựịnh vi khuẩn Ẹ coli phân lập ựược.
3.5.3.1.Kiểm tra hình tháị
Từ giống phân lập giữ trên thạch máu cấy chuyển ra nước thịt hoặc thạch nghiêng làm tiêu bản nhuộm Gram ựể kiểm trạ Vi khuẩn Ẹ coli sẽ bắt màu ựỏ (Gram âm).
3.5.3.2. Kiểm tra khả năng di ựộng.
- Kiểm tra khả năng di ựộng bằng phương pháp cấy chắch sâu vi khuẩn vào thạch mềm.
- Phương pháp làm: dùng que cấy ựầu nhọn vô trùng lấy vi khuẩn cấy chắch sâu vào giữa ống thạch mềm ựến gần ựáy thì rút rạ để ống nuôi cấy trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
- Kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng di ựộng thì dọc theo ựường cấy vi khuẩn mọc lan rạ
3.5.3.3. Kiểm tra tắnh chất mọc.
- Nuôi cấy vi khuẩn trên các môi trường: nước thịt thạch thường thạch máu các môi trường ựặc biệt như: Istrati, MacConkey, thạch Brilliant green, nước thịt gan yếm khắ, thạch máu yếm khắ. Quan sát tắnh chất mọc hình thái kắch thước và mầu sắc khuẩn lạc.
3.5.3.4. Giám ựịnh các ựặc tắnh sinh hóạ - Khả năng lên men các loại ựường:
Trong môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth bổ sung thêm 1,5 ml xanh Bromothymol 1,5% trong cồn và các loại dung dịch ựường cần kiểm tra cấy vi khuẩn vào bồi dưỡng trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ ựọc kết quả. Phản ứng dương tắnh khi môi trường chuyển màu hồng, và ngược lại nếu âm tắnh môi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40 trường vẫn giữ nguyên màu sắc ban ựầụ
- Phản ứng sinh Indol:
Nhỏ thuốc thử Kowacs vào môi trường Peptol ựã nuôi cấy vi khuẩn. Phản ứng dương tắnh khi có một vòng tròn ựỏ xuất hiện trên mặt môi trường. Phản ứng âm tắnh khi không có vòng ựỏ trên bề mặt môi trường.
- Phản ứng Oxidaza:
+ được làm trên giấy có tẩm dung dịch 1% Tetramethuyl Ờ P.pheny diamine hydrochloridẹ
+ Phương pháp làm: Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ môi trường thạch chà sát lên mặt giấy ựã thấm thuốc thử. Nếu chỗ chà sát sau 30 giây xuất hiện màu tắm ựen là phản ứng dương tắnh. Nếu không xuất hiện màu tắm ựen hoặc không ựổi màu là phản ứng âm tắnh.
- Phản ứng catalaza:
Phương pháp làm: Lấy một phiến kắnh sạch dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch ựặt lên phiến kắnh sạch nhỏ 1 giọt dung dịch H2O2 3% (hydrogen peroxidaza). Nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tắnh nếu không thấy sủi bọt là phản ứng âm tắnh.
- Phản ứng thử V.P. (Voges Proskauer):
Cấy vi khuẩn vào môi trường Peptol glucoza 37oC trong 2-4 ngày sau ựó nhỏ thuốc thử (NaOH 40g/100ml nước cất hoặc dung dịch pootat) sau 5 phút nếu có màu ựỏ hồng là dương tắnh có thể phản ứng sau 4-5 giờ mới xuất hiện.
- Phản ứng thử M.R (Methuyl Rouge):
Cấy vi khuẩn vào môi trường Peptol glucoza 37oC trong vòng 2-4 ngày sau ựó nhỏ 2-3 giọt dung dịch ựỏ methyl 0.04% trong cồn 95o vào sau 5 phút nếu có màu ựỏ là phản ứng dương tắnh màu vàng là âm tắnh giữa màu ựỏ và màu vàng là phản ứng nghi ngờ.
3.5.4. Phương pháp xác ựịnh một số yếu tố có liên quan ựến ựộc lực của vi khuẩn Ẹ coli khuẩn Ẹ coli
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
3.5.4.1. Phản ứng ngưng kết hồng cầu ựể xác ựịnh F1 Fimbriae
- Nguyên lý: F1 Fimbriae của Ẹ coli có ựặc tắnh rất nhạy với sự có mặt của ựường D-Mannose và gây kết dắnh hồng cầu của một số loài ựộng vật như chuột lang, bò, cừu gà và ngườị
- Phương pháp: ựược tiến hành như mô tả của Jone & Rutter (1974) với một số cải tiến:
+ Chuẩn bị hồng cầu: (Red Blood Cell Ờ RBC): máu bò ựực hoặc của cừu, gà ựược lấy tươi trong 3,8% dung dịch Sodium citrat. Máu ựược ly tâm trong vòng (2500vòng/phút trong 10 phút) rửa 3 lần với thể tắch PBS gấp 10 lần (PH=7,2) (PBS hoặc với 2,5% D- mannose ựể ựược dung dịch hồng cầu 3%. Hồng cầu sau ựó ựược dùng ngay hoặc giữ trong tủ lạnh 40C trong 1-2 ngàỵ
+ Chuẩn bị vi khuẩn: Chủng vi khuẩn kiểm tra ựược nuôi cấy trong môi trường BHI bồi dưỡng ở tủ ấm 370C trong 72 giờ không lắc. Lặp lại qui trình nuôi cấy này từ 4-6 lần. Canh khuẩn sau ựó ựược ly tâm 3500 vòng /phút trong 15 phút và pha loãng trong PBS (PH= 7,2) ựể ựược nồng ựộ cuối cùng khoảng 1010 vi khuẩn/ml.
+ Phản ứng: ựược thực hiện trong ựĩa nhựa 96 lỗ, ựáy tròn với một lượng tương ựương hồng cầu và huyễn dịch vi khuẩn (50ộl). Từ nồng ựộ nguyên ban ựầu tiến hành pha loãng huyễn dịch vi khuẩn theo cơ chế 2 (log2) trong dung dịch PBS (PH=7,2) sau ựó cho vào mỗi giếng 50ộl 3% RBC hoặc 3% RBC + Mannose ủ ở 40C trong 2giờ.
+ đọc kết quả: Phản ứng dương tắnh, có biểu hiện ngưng kết lấm tấm ở ựáy giếng. Phản ứng âm tắnh, hồng cầu lắng thành một lớp ựều ở ựáy giếng.
3.5.4.2. Phương pháp PCR ựể xác ựịnh một số yếu tố ựộc lực cơ bản của vi khuẩn Ẹ coli
- Các bước tiến hành:
+ DNA mẫu: Khuẩn lạc vi khuẩn Ẹ coli mọc trên môi trường thạch máu ở 37oC trong 24 giờ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42 Primers : 1ộl mỗi loại
Dung dịch ựệm (5X) : 5.0ộl Enzyme (Taq polymerase): 0.05ộl
Nước khử ion vừa ựủ ựể ựạt ựược thể tắch cuối cùng là 25ộl/ phản ứng. + Chu trình phản ứng PCR:
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhaụ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và thực hiện trong máy nhân gen tự ựộng (Parkin Elmer) theo Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khái quát qui trình xác ựịnh một số yếu tố ựộc lực của Ẹ coli
Chu trình
thứ 1 30 chu trình tiếp theo
Chu trình cuối Loại yếu tố gây bệnh cần xác ựịnh Biến tắnh (oC/ phút) Biến tắnh (oC/ phút) Gắn mồi (oC/ phút) Tổng hợp (oC/ phút) Tổng hợp (oC/ phút) STa STb LT 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 F1 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7
+ Chạy ựiện di: Sản phẩm PCR thu ựược sau chu trình phản ứng ựược nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) ựược trộn với mẫu theo tỷ lệ 1:5. Sau khi nhuômsản phẩm PCR ựược chạy ựiện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch ựệm TAE (Tris Ờ Acetic Ờ EDTA) với hiệu ựiện thế 100V trong vòng 40 phút. đây là cách làm cho các ựoạn acid nucleic hiện thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các acid nucleic trong môi trường pH trung tắnh thì tắch ựiện âm nhờ nhóm photphat nằm trên khung phosphodiesrer của các sợi nucleic. Khi ựặt chúng vào ựiện trường các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tắch trên thạch
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43 agarose các phân tử acid nucleic tùy theo kắch thước sẽ chuyển dịch với tốc ựộ khác nhau: Loại phân tử có kắch thước lớn chạy chậm loại có kắch thước bé sẽ chuyển dịch nhanh hơn.
+ Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy ựiện di ựược nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (bet 1ộl/ml) trong vòng 15 phút. Bet là loại chất nhuộm màu huỳnh quangphân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazọ Vị trắ cố ựịnh của các nhóm có khoảng cách gần với bazo tạo ra 1 lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử Bet tự dọ
+ đọc kết quả: Bằng cách quan sát dưới ánh ựèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trên ảnh chụp nền ựen các ựoạn acid nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh ựược và ghi nhận lạị Kắch thước các dải băng DNA ựược so sánh với DNA chuẩn ựược cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác ựịnh ựược ựộ dài các ựoạn sản phẩm PCR.
3.5.5. Kiểm tra ựộc lực của các chủng vi khuẩn Ẹ coli phân lập ựược trên chuột bạch. chuột bạch.
để xác ựịnh ựộc lực của vi khuẩn gây bệnh có thể thực hiện bằng phương pháp tiêm truyền qua ựộc vật thắ nghiệm, theo phương pháp của Carter (1984) theo các bước:
Bước 1: Các vi khuẩn thuần khiết từ môi trường giữ giống ựược cấy