Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
3.5.4.1. Phản ứng ngưng kết hồng cầu ựể xác ựịnh F1 Fimbriae
- Nguyên lý: F1 Fimbriae của Ẹ coli có ựặc tắnh rất nhạy với sự có mặt của ựường D-Mannose và gây kết dắnh hồng cầu của một số loài ựộng vật như chuột lang, bò, cừu gà và ngườị
- Phương pháp: ựược tiến hành như mô tả của Jone & Rutter (1974) với một số cải tiến:
+ Chuẩn bị hồng cầu: (Red Blood Cell Ờ RBC): máu bò ựực hoặc của cừu, gà ựược lấy tươi trong 3,8% dung dịch Sodium citrat. Máu ựược ly tâm trong vòng (2500vòng/phút trong 10 phút) rửa 3 lần với thể tắch PBS gấp 10 lần (PH=7,2) (PBS hoặc với 2,5% D- mannose ựể ựược dung dịch hồng cầu 3%. Hồng cầu sau ựó ựược dùng ngay hoặc giữ trong tủ lạnh 40C trong 1-2 ngàỵ
+ Chuẩn bị vi khuẩn: Chủng vi khuẩn kiểm tra ựược nuôi cấy trong môi trường BHI bồi dưỡng ở tủ ấm 370C trong 72 giờ không lắc. Lặp lại qui trình nuôi cấy này từ 4-6 lần. Canh khuẩn sau ựó ựược ly tâm 3500 vòng /phút trong 15 phút và pha loãng trong PBS (PH= 7,2) ựể ựược nồng ựộ cuối cùng khoảng 1010 vi khuẩn/ml.
+ Phản ứng: ựược thực hiện trong ựĩa nhựa 96 lỗ, ựáy tròn với một lượng tương ựương hồng cầu và huyễn dịch vi khuẩn (50ộl). Từ nồng ựộ nguyên ban ựầu tiến hành pha loãng huyễn dịch vi khuẩn theo cơ chế 2 (log2) trong dung dịch PBS (PH=7,2) sau ựó cho vào mỗi giếng 50ộl 3% RBC hoặc 3% RBC + Mannose ủ ở 40C trong 2giờ.
+ đọc kết quả: Phản ứng dương tắnh, có biểu hiện ngưng kết lấm tấm ở ựáy giếng. Phản ứng âm tắnh, hồng cầu lắng thành một lớp ựều ở ựáy giếng.
3.5.4.2. Phương pháp PCR ựể xác ựịnh một số yếu tố ựộc lực cơ bản của vi khuẩn Ẹ coli
- Các bước tiến hành:
+ DNA mẫu: Khuẩn lạc vi khuẩn Ẹ coli mọc trên môi trường thạch máu ở 37oC trong 24 giờ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42 Primers : 1ộl mỗi loại
Dung dịch ựệm (5X) : 5.0ộl Enzyme (Taq polymerase): 0.05ộl
Nước khử ion vừa ựủ ựể ựạt ựược thể tắch cuối cùng là 25ộl/ phản ứng. + Chu trình phản ứng PCR:
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhaụ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và thực hiện trong máy nhân gen tự ựộng (Parkin Elmer) theo Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khái quát qui trình xác ựịnh một số yếu tố ựộc lực của Ẹ coli
Chu trình
thứ 1 30 chu trình tiếp theo
Chu trình cuối Loại yếu tố gây bệnh cần xác ựịnh Biến tắnh (oC/ phút) Biến tắnh (oC/ phút) Gắn mồi (oC/ phút) Tổng hợp (oC/ phút) Tổng hợp (oC/ phút) STa STb LT 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 F1 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7
+ Chạy ựiện di: Sản phẩm PCR thu ựược sau chu trình phản ứng ựược nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) ựược trộn với mẫu theo tỷ lệ 1:5. Sau khi nhuômsản phẩm PCR ựược chạy ựiện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch ựệm TAE (Tris Ờ Acetic Ờ EDTA) với hiệu ựiện thế 100V trong vòng 40 phút. đây là cách làm cho các ựoạn acid nucleic hiện thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các acid nucleic trong môi trường pH trung tắnh thì tắch ựiện âm nhờ nhóm photphat nằm trên khung phosphodiesrer của các sợi nucleic. Khi ựặt chúng vào ựiện trường các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tắch trên thạch
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43 agarose các phân tử acid nucleic tùy theo kắch thước sẽ chuyển dịch với tốc ựộ khác nhau: Loại phân tử có kắch thước lớn chạy chậm loại có kắch thước bé sẽ chuyển dịch nhanh hơn.
+ Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy ựiện di ựược nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (bet 1ộl/ml) trong vòng 15 phút. Bet là loại chất nhuộm màu huỳnh quangphân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazọ Vị trắ cố ựịnh của các nhóm có khoảng cách gần với bazo tạo ra 1 lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử Bet tự dọ
+ đọc kết quả: Bằng cách quan sát dưới ánh ựèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trên ảnh chụp nền ựen các ựoạn acid nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh ựược và ghi nhận lạị Kắch thước các dải băng DNA ựược so sánh với DNA chuẩn ựược cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác ựịnh ựược ựộ dài các ựoạn sản phẩm PCR.