Khi đĩa đã mọc khuẩn lạc tiến hành hoạt hóa giống.
Dùng que cấy lấy sinh khối từ đĩa môi trường cho vào ống nghiệm có chứa 5ml môi trường NB lỏng hoạt hóa 24 giờ trong tủ lắc ở 37o
C (tiến hành cấy trong điều kiện vô trùng).
Để giống có hoạt tính mạnh ta tiến hành hoạt hóa vài lần. Dùng que cấy, cấy giống đã hoạt hóa rồi vào ống nghiệm có chứa môi trường hoạt hóa khác và tiếp tục lắc qua đêm trong tủ lắc. Các lần lắc sau cũng thực hiện tương tự như trên.
2.4.2. Ly tâm thu nhận dịch chiết từ tỏi, lá sả a. Dịch chiết từ tỏi a. Dịch chiết từ tỏi Ngâm Tỏi tươi Bóc vỏ Bã Tủa Định lượng Ngâm Ly tâm lạnh Lọc sơ bộ Lọc vô trùng Cồn 70o Cồn 75o Cồn 90o Cồn 85o Cồn 80o Erlen vô trùng Nước cất vô trùng Cồn thực phẩm Giấy lọc t: 15 phút to: 4oC v: 8000 rpm/phút Màng lọc Vô trùng Nghiền nhỏ Dịch chiết tỏi Tỉ lệ: 1:10
Thuyết minh:
Tỏi tươi: chọn tỏi tươi còn nguyên tép không bị dập nát, không vỡ vụn vì khi tỏi bị dập nát thì aliin trong tinh dầu sả sẽ bị chuyển hóa thành allicin – là hợp chất lưu huỳnh có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất của tinh dầu tỏi. Tuy nhiên hợp chất này rất dễ bị phân hủy (dù ở điều kiện thường) và tạo thành vinyldithiines có hoạt tính yếu hơn allicin. Khi xay tỏi thành dạng bột mịn thì hoạt tính kháng khuẩn bị giảm do hàm lượng allin giảm xuống ở mức rất thấp (khoảng 1%) nên lượng allicin tao thành ít làm giảm hoạt tính kháng khuẩn.
Bóc vỏ: loại bỏ tạp chất, bụi bẩn, tạo điều kiện cho việc nghiền nhỏ được dễ dàng hơn.
Nghiền nhỏ: tỏi được nghiền nhỏ tạo điều kiện cho các aliin chuyển hóa thành allicin dưới tác dụng của enzyme allicinesa. Nghiền tỏi tạo điều kiện cho các hợp chất lưu huỳnh được hình thành giúp tăng cường khả năng kháng khuẩn của dịch chiết. Tuy nhiên, sau khi nghiền nhỏ nên sử dụng ngay trong thời gian ngắn tránh mất đi hoạt tính của dịch chiết.
Hình 2.1Tỏi tươi bóc vỏ
Định lượng: sau khi đã nghiền nhỏ, tỏi được cân định lượng theo tỉ lệ thích hợp với hàm lượng dung môi sử dụng. Theo Toye J. Ekunsanmi Department of Biology University of Wisconsin, tỏi sau khi nghiền nhỏ được phối trộn với nước cất vô trùng và cồn theo tỉ lệ 1:10
Ngâm: sau khi định lượng, ngâm tỏi trong khoảng thời 15 – 30 phút cho aliin chuyển hóa thành allicin. Không nên ngâm quá lâu sẽ làm mất hoạt tính của allicin.
Ly tâm lạnh: đối với dung môi cồn (thực phẩm), tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết ở các nồng độ khác nhau lần lược như: 70o, 75o, 80o, 85o và 90o. Tỏi được ngâm trong dung môi cồn (thực phẩm) ở các nồng độ lần lược như trên. Sau khi ngâm ta tiến hành ly tâm lạnh. Cho tỏi đã ngâm cồn (thực phẩm) vào ống appendorf (2ml) đã vô trùng tiến hành ly tâm trên máy ly tâm lạnh với công suất 13000 rpm/phút. Điều kiện ly tâm:
- Nhiệt độ: 4oC - Thời gian: 15 phút
- Vận tốc quay: 8000 rpm/phút.
Khi tiến hành ly tâm thì các hoạt tính kháng khuẩn trong tỏi được trích ly ra ngoài dung môi phần xác tỏi sẽ bị tủa xuống dưới đáy ống appendprf.
Sau quá trình ly tâm lạnh, loại bỏ phần tủa ở dưới ta thu được dịch chiết tỏi ở phần trên ống appendorf.
Lọc sơ bộ: sau khi tỏi được ngâm trong nước cất vô trùng, tiến hành lọc sơ bộ với mục đích loại bỏ phần bã của tỏi và chuẩn bị cho quá trình lọc vô trùng được dễ dàng hơn.
Lọc vô trùng: sau khi đã loại bỏ phần bã của tỏi, tiến hành lọc vô trùng. Quá trình lọc vô trùng được tiến hành trong điều kiện vô trùng. Sử dụng ống tiêm vô trùng hút dịch đã qua lọc sơ bộ bơm qua màng lọc vô trùng đường kính 0,2nm. Dịch lọc qua màng lọc vô trùng được bơm vào bình tam giác đã vô trùng từ trước thu được dịch chiết tỏi.