3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.3.4. Xác định type của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kháng huyết thanh đơn giá O, H của hãng SIFIN (Đức) và Bio RAD (Pháp).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sử dụng khay thuỷ tinh trong đó có các giếng nhỏ. Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh vào giếng, dùng que cấy vô trùng lấy 1 phần khuẩn lạc cần định type từ thạch nuôi cấy, trộn đều khuẩn lạc và kháng huyết thanh, lắc nhẹ và quan sát:
+ Phản ứng dương tính: có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti. + Phản ứng âm tính: huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đồng nhất không có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi đục.
Đối với các chủng sau khi định được kháng nguyên O, H1 mà chưa định được type thì phải xác định pha 2 của kháng nguyên H. Sau khi xác định kháng nguyên H pha 1 theo sơ đồ trên, tiến hành xác định pha 2 như sau:
- Chuẩn bị thạch Sven Gard: đây là môi trường bán cố thể, có bán sẵn trên thị trường, chỉ cần pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dùng đĩa có đường kính 6cm. trước khi đổ thạch nhỏ 1 giọt nhỏ Anti Sven Gard Serum với mục đích ức chế pha 1.Tuỳ theo pha 1 mà có loại Anti Sven Gard Serum khác nhau ví dụ SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6.
- Sau khi đã có thạch Sven Gard, dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn đã xác định được kháng nguyên H pha 1, chấm nhẹ lên bề mặt thạch ở giữa đĩa thạch.
- Nuôi ở 37oC/24h.
- Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính tương tự như đối với pha 1.
* Xác định type Salmonella bằng kháng huyết thanh theo Kauffmann- White (Salmonella serotyping following Kauffmann Scheme) (năm 1972).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.1: Bảng định type huyết thanh học của vi khuẩn Salmonella theo Kauffmann-White (1972) [59]
Nhóm Type Kháng nguyên O Kháng nguyên H
Pha 1 Pha 2 A S. paratyphi A 1,2,12 a [1,5] B S. derby 1,4,[5],12 f,g [1,2] S. typhimurium 1,4,[5],12 i 1,2 S. saintpaul 1,4,[5],12 e,h 1,2 S. agona 1,4,[5],12 f,g,s [1,2] S. paratyphi B 1,4,[5],12 b 1,2 S. london 4,12 e,h 1,6 C1 S. paratyphi C 6,7,[Vi] c 1,5 S. cholerae suis 6,7 c 1,5 S. rissen 6,7,14 f,g - D S. typhi 9, 12 (Vi) d - S. enteritidis 1, 9, 12 g, m [1, 7] 2.3.5. Xác định khả năng sản sinh độc tố
2.3.5.1. Phương pháp xác định kháng nguyên bám dính của vi khuẩn Chuẩn bị kháng nguyên Chuẩn bị kháng nguyên
Rửa các chủng vi khuẩn trên bề mặt các môi trường thạch đĩa bằng dung dịch nước muối sinh lý 0, 85%, thu lấy huyễn dịch vi khuẩn. Hoặc canh khuẩn được bồi dưỡng có lắc để đạt khoảng 108
vi khuẩn/ml, bảo quản huyễn dịch thu được ở 40
C.
Máu cừu khoẻ mạnh được lấy vào bình có Citrat natri, máu được rửa 3 lần bằng dung dịch Phosphat buffer Saline (PBS) bằng cách ly tâm 3000 vòng/phút với thời gian 30 phút. Sau lần rửa thứ 3 gạn bỏ phần nước trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trên và giữ hồng cầu, bảo quản ở 40C. Khi tiến hành phản ứng, pha hồng cầu gà với nước muối sinh lý thành nồng độ 3%.
Đối với vi khuẩn Salmonella, kháng nguyên bám dính là CFA1, để tiến hành phản ứng này dùng hồng cầu gà.
Tiến hành phản ứng
Phản ứng được thực hiện trên khay Takashi (khay nhựa 96 lỗ), các bước tiến hành như sau:
+ Bước 1: Dùng Micropipet nhỏ vào mỗi giếng 0,025 ml dung dịch
nước muối sinh lý 0,85%.
+ Bước 2: Cho vào lô thứ nhất 0,025 ml canh khuẩn chuẩn bị ở trên rồi
pha huyễn dịch vi khuẩn theo hệ số 2: (1/2, 1/4, 1/8, 1/16…) ở 8 lỗ hàng cuối cùng không pha, để nguyên nước muối sinh lý làm đối chứng).
+ Bước 3: cho vào mỗi lỗ huyễn dịch trên 0, 025 ml dịch máu cừu hoặc
gà nồng độ 3%.
Lắc nhẹ nhàng khay nhựa cho các thành phần hoà trộn đều vào nhau, đậy kín khay và cho vào ở 40
C, sau 2- 4 giờ đọc kết quả.
Đánh giá kết quả thu được
Phản ứng dương tính: khi xuất hiện ngưng kết hồng cầu, đánh giá theo 4 cấp độ sau:
(+) : khi có khoảng 25% lượng hồng cầu ngưng kết ở dưới (++) : khi có khoảng 50% lượng hồng cầu ngưng kết ở dưới (+++) : khi có khoảng 75% lượng hồng cầu ngưng kết ở dưới (++++): khi 100% lượng hồng cầu ngưng kết ở dưới
Phản ứng đánh giá âm tính: khi không có hiện tượng ngưng kết trên và giống như đối chứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.5.2. Xác định độc tố của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được bằng phương pháp khuếch tán trên da thỏ
Phương pháp (Intradermal Test) được thực hiện và đánh giá theo Sanderfur và Peterson (1997)[73].
Vi khuẩn Salmonella cần xác định độc tố được cấy trong môi trường BHI bồi dưỡng ở 37oC có lắc (cấy vào bình 100ml với lượng môi trường 20 - 30ml).
- Sau 3 giờ nuôi cấy cho vào một lượng lincomycin, sao cho nồng độ kháng sinh cuối cùng trong môi trường đạt 0,5 mg/ml.
- Sau 24 giờ nuôi cấy canh trùng đem ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút bỏ cặn lấy nước trong và chia làm 2 phần.
+ Phần bảo quản ở 4oC để thử độc tố không chịu nhiệt.
+ Phần đun cách thủy 80oC trong 30 phút rồi bảo quản ở 4oC để thử độc tố chịu nhiệt.
- Thỏ lớn, trọng lượng 2,8 - 3kg được cắt lông phần lưng bằng kéo cong, dùng kem rụng lông bôi sau 10 phút gạt sạch kem, lau khô da (chú ý không làm trầy, xước da).
Dùng bút dạ chia phần lưng thỏ trụi lông thành ô vuông, mỗi ô có cạnh 2cm. Tiêm trong da ở giữa ô 0,1ml dung dịch độc tố của chủng đã chuẩn bị ở trên, mỗi mẫu tiêm 2 ô ở vị trí cách xa nhau. Đối chứng âm trên 0,1ml môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn.
- Sau khi tiêm 2 giờ (với thỏ tiêm độc tố đã đun ở 80oC) và sau 18 giờ (với thỏ tiêm độc tố không đun) bắt thỏ tiêm tĩnh mạch 3 - 5 ml dung dịch Evanblue đủ lượng 40 mg/kg thể trọng.
- Thỏ được nuôi tiếp 2 giờ và đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính: diện tích da thỏ quanh chỗ tiêm khoảng 4 x 4mm có màu xanh của Evanblue. Sau đó giết thỏ để đọc kết quả dưới da.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Phản ứng nghi ngờ: ô vuông xuất hiện màu xanh với diện tích < 16mm2
. - Sau khi đọc kết quả bên ngoài, giết thỏ lột da, lật ngược da để đọc kết quả trong da.
2.3.6. Xác định độc lực của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được
2.3.6.1. Tiêm truyền động vật thí nghiệm
Chuẩn bị:
- Động vật thí nghiệm: Chuột bạch khoẻ mạnh 20 - 25 g/con.
- Canh khuẩn nuôi cấy các giống vi khuẩn Salmonella, bồi dưỡng ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
- Dụng cụ: dao, kéo, kim tiêm, nhiệt kế, cồn, bong, màu đánh dấu, bút ghi và giấy trắng.
Tiến hành
Tiến hành theo phương pháp của Carter và cs (1995)[54].
Mỗi chủng vi khuẩn tiêm cho 5 chuột, liều 0,2 ml canh trùng nuôi cấy 24 giờ/ 37oC vào phúc mạc. Theo dõi số chuột chết và thời gian giết chết chuột của vi khuẩn trong 5 ngày. Chuột chết được mổ lấy máu tim và phủ tạng nuôi cấy phân lập để kiểm tra.
2.3.6.2. Phương pháp xác định LD50 của vi khuẩn S. typhimurium và S. enteritidis phân lập được từ vịt phân lập được từ vịt
Liều LD50 là liều vi sinh vật hoặc độc tố của chúng giết chết 50% động vật thí nghiệm trong một thời gian nhất định.
Phương pháp tiến hành:
- Chọn chủng S. typhimurium và S. enteritidis có độc lực mạnh tiêm
cho chuột nhắt trắng có trọng lượng 20 - 25 gram.
- Pha loãng canh trùng vi khuẩn cần kiểm tra đã được nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ theo hệ số 10 từ 10-1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Tiêm 0,2ml canh trùng ở mỗi độ pha loãng vào xoang bụng cho mỗi chuột thí nghiệm. Mỗi độ pha loãng tiêm cho 5 chuột.
- Theo dõi số chuột sống và chết sau 7 ngày.
- Xác định tỷ lệ chuột sống và chết ở mỗi độ pha loãng. Tính LD50
- Xác định tỷ lệ chuột sống và chết ở mỗi độ pha loãng. % chết =
100 x số lượng chết Tổng số chết + tổng số sống
- Tính LD50 theo công thức của Reed - Muench: LgLD50 = LgA +
a - 50
x d a - b
Trong đó:
LD50: liều gây chết 50% động vật thí nghiệm
A: bậc pha loãng ở liều gây chết cận trên 50% động vật thí nghiệm a: tỷ lệ chết cận trên 50% động vật thí nghiệm đối với liều A. b: tỷ lệ chết cận dưới 50% động vật thí nghiệm đối với liều A. d: lg của độ pha loãng (nên bậc 10 sẽ là -1).
2.3.6.3. Gây bệnh thực nghiệm trên vịt
Đối tượng gây bệnh: vịt con 10 ngày tuổi
Cách tiến hành: tiêm cho mỗi vịt con 0,2 ml canh trùng nguyên của vi khuẩn cần kiểm tra được nuôi cấy trên môi trường BHI ở nhiệt độ 37o
C trong 24 giờ, tiêm dưới da hoặc xoang bụng. Lô đối chứng chỉ tiêm môi trường nước sinh lý.
Theo dõi triệu chứng, thời gian vịt chết, mổ khám kiểm tra bệnh tích và tiến hành phân lập lại vi khuẩn từ vịt chết.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.7.Xác định tính mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng Salmonella
phân lập được
Phương pháp kháng sinh đồ của Kirby- Bauer, dùng để đánh giá tính mẫn cảm với các loại kháng sinh của vi khuẩn được mô tả bởi Cater (1975)[53] sử dụng trong thí nghiệm này.
2.3.7.1. Chuẩn bị
+ Chủng vi khuẩn Salmonella được nuôi cấy trong môi trường BHI, bồi dưỡng ở nhiệt độ 370
C sau 24 giờ.
+ Dùng môi trường thạch thường đã chuẩn bị đổ vào hộp lồng sao cho đảm bảo mặt thạch dầy 4 mm (đã được kiểm tra vô trùng).
+ Giấy tẩm kháng sinh, panh vô trùng, micropipet.
2.3.7.2. Tiến hành
Dùng micropipet vô trùng lấy 0,2 ml canh trùng trên, nhỏ lên trên mặt đĩa thạch, láng đều trên mặt thạch, hút hết canh trùng thừa, để yên ở nhiệt độ phòng từ 3-5 phút cho khô mặt thạch.
Dùng panh kẹp giấy tẩm kháng sinh đặt cố định lên trên mặt đĩa thạch đã được láng đều canh khuẩn, sao cho các tấm giấy này tiếp xúc với mặt thạch và cách nhau không quá 15 mm. Giữ yên 15 phút rồi lật úp đĩa thạch, để ở nhiệt độ 370
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.7.3. Đọc kết quả
Bảng 2.2: Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh
Tên thuốc Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Mẫn cảm cao Mẫn cảm Kháng thuốc Ampicillin ≥ 14 12 - 13 ≤ 11 Neomycin ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 Amoxycillin ≥ 18 14 - 17 ≤ 13 Enrofloxacin ≥ 23 17 - 22 ≤ 16 Ciprofloxacin ≥ 22 13 - 21 ≤ 12 Colistin ≥ 15 13 - 14 ≤12 Kanamycin ≥ 18 15 - 17 ≤ 14 Gentamicin ≥ 16 14 - 16 ≤ 13 Lincomycin ≥15 13 - 14 ≤12 Norfloxacin ≥ 25 17 - 24 ≤ 16 Neomycin ≥15 13 - 14 ≤12 Tetracyclin ≥23 19 - 22 ≤18 Cefazidin ≥20 15 - 19 ≤14 Amikacin ≥17 15 - 16 ≤14
2.3.8. Xây dựng phác đồ điều trị bệnh Phó thương hàn vịt
Qua xác định sự mẫn cảm của các vi khuẩn gây bệnh phân lập được với một số kháng sinh, hoá dược bằng phương pháp kháng sinh đồ trên đĩa thạch, trên cơ sở đó lựa chọn phác đồ điều trị bệnh thích hợp. Để đánh giá được hiệu quả một cách khách quan, các phác đồ được thực hiện có sự đồng đều tương đối về các tiêu chí cơ bản sau:
- Số vịt bị bệnh Phó thương hàn ở cùng một địa điểm được phân ra một cách ngẫu nhiên làm 3 lô tương ứng với 3 phác đồ điều trị bệnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Số lần và ngày điều trị bệnh được dùng đồng đều trong các phác đồ. - Trong 3 phác đồ, sự khác nhau là việc sử dụng các loại thuốc kháng sinh khác.
- Đánh giá hiệu quả của các phác đồ điều trị bệnh căn cứ vào sự ổn định dần về các triệu chứng biểu hiện bệnh và tình trạng ăn uống sau 4 - 7 ngày kể từ khi dùng thuốc.
Các phác đồ dùng trong điều trị như sau:
Phác đồ I: NORFACOLI: 1 gram/20 kg TT Điện giải: 1 g/lít nước uống
B.complex: 1 g/3 lít nước uống.
Norfacoli là sản phẩm của công ty CP dược và vật tư thú y HANVET, Trong 10 gram có: 10000 mg Norfloxacin, 100 mg vitamin B1, 250 mg vitamin C, 15 gram vitamin K 3, 200 mg Niacin, tá dược vừa đủ
Phác đồ II:
T.COLIVIT: 1 g/5 kg TT. Hòa nước cho uống hoặc trộn thức ăn cho ăn. Điện giải: 1g/lít nước uống
B.complex: 1g/3 lít nước uống.
Thuốc T.colivit là sản phẩm của công ty thuốc thú y Năm Thái. Trong 100 g chế phẩm có:
Oxytetracyclin HCl: 9 000 mg Neomycin : 6 000 mg
Phác đồ III: HANCIPRO - 50: 1 ml/lít nước uống. Điện giải: 1 g/lít nước uống
B.complex: 1 g/3 lít nước uống
Hancipro là sản phẩm của công ty cổ phần dược và vật tư thú y HANVET. Trong 100 ml chế phẩm chứa: Ciprofloxacin: 5 000 mg.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp nghiên cứu trong chăn nuôi của Nguyễn Văn Thiện, 1997[40] với các tham số cơ bản:
Các tham số thống kê cơ bản: - Số trung bình mẫu: xi
X = n
xi : Tổng các giá trị của x n : Dung lượng mẫu. X : Số trung bình mẫu. - Độ lệch tiêu chuẩn: + Với n > 30: 2 2 i i x Σx Σx S n n + Với n 30: 2 2 i i x Σx Σx S n - 1 n
Trong đó: SX: Độ lệch tiêu chuẩn Xi : Giá trị của mẫu n : Dung lượng mẫu
- Sai số của số trung bình:
+ Với n > 30: x x S m n + Với n 30: x x S m n - 1
Trong đó: mX: Sai số của số trung bình
SX : Độ lệch tiêu chuẩn n : Dung lượng mẫu
- Phương pháp thống kê sinh học của Pascal Leroy, Frédéric Farnir (Người dịch Đặng Vũ Bình - 1999)[29].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella trên vịt tại Hƣng Yên.
Chúng tôi tiến hành kiểm tra 198 mẫu thí nghiệm được lấy từ: lách, manh tràng, trứng tắc, trứng thường, nước môi trường và thức ăn của vịt. Sau khi thu thập mẫu thí nghiệm được xử lý, nuôi cấy và phân lập tại Bộ môn Vệ sinh gia súc - Viện Thú y, kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3. 1: Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella trên vịt STT Đia điêm lấy mẫu Số mẫu nghiên cứu Mẫu dƣơng tính (+) Tỷ lệ (%) 1 H. Kim Động 58 11 18,96 2 H. Tiên Lữ 72 18 25,00 3 H. Ân Thi 68 12 17,64 Tính chung 198 41 20,70
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy trong tổng số 198 mẫu thu thập từ các cơ sở chăn nuôi thuộc thuộc tỉnh Hưng Yên thì các huyện khác nhau có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella cũng khác nhau, tỷ lệ nhiễm cao nhất là mẫu ở
huyện Tiên Lữ (25,00%), sau là đến mẫu ở huyện Kim động (18,96%), trong mẫu ở huyện Ân Thi là thấp thất (17,64%) thấy sự có mặt của vi khuẩn
Salmonella. Tỷ lệ nhiễm Salmonella chung là 20,70%. Nguyên nhân làm cho
tỷ lệ nhiễm Salmonella cao ở Huyện Tiên Lữ là do điều kiện chăm sóc còn