3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.3.2.Phương pháp phân lập vi khuẩn theo ISO 6579
Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc.
Mẫu bệnh phẩm lách: lấy lách mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng rồi cân, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37o
C trong vòng 16-18 h.
Mẫu bệnh phẩm manh tràng: vô trùng bên ngoài manh tràng rồi dùng kéo và panh tuốt phân trong manh tràng cho vào túi dập mẫu vô trùng rồi cân, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37o
C trong vòng 16-18 h.
Mẫu là trứng vịt trắng và trứng chết phôi: lấy 25g mẫu (lấy phần lòng đỏ và phần noãn hoàng) cho vào túi dập mẫu vô trùng, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37o
C trong vòng 16-18h.
Mẫu là nước môi trường chăn nuôi: lấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37o
C trong vòng 16-18h.
Mẫu là thức ăn của vịt: lấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37oC trong vòng 16-18h.
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc.
Dùng pipet vô trùng hút 1-1,2ml dung dịch tăng sinh không chọn lọc, nhỏ 3 giọt vào thạch bán cố thể MSRV (để kiểm tra sự di động của vi khuẩn
Salmonella), để vào tủ ấm 41.50
C/24-48 h. Còn lại cho vào ống nghiệm có chứa 10 ml môi trường Muller Kauffmann, dùng máy (vortex) lắc đều, để vào tủ ấm 370
C/18-24 h.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
giọt canh khuẩn. Ở môi trường Muller Kauffmann hỗn dịch có thể biến đổi màu sắc.
Bước 3: Phân lập trên các môi trường chọn lọc
Dùng que cấy có đường kính 1μm lấy 1 vòng canh trùng từ môi trường MSRV (lấy ở vị trí vi khuẩn lan xa nhất) ria cấy sang đĩa thạch Rambach, để tủ ấm 370C/18 - 24 h. Khuẩn lạc Salmonella tròn trơn, nhẵn bóng, có màu đỏ hoặc hồng cánh sen.
Dùng que cấy có đường kính 10 μm lấy 1 vòng canh trùng từ ống tăng sinh Muller Kauffmann (trước khi lấy phải dùng máy lắc đều hỗn dịch trong ống) ria cấy sang đĩa thạch XLT4. Cấy làm 3 đường cấy và thưa dần để tách khuẩn lạc riêng rẽ. Để tủ ấm 370
C/18 - 24 h. Khuẩn lạc Salmonella tròn, bóng lồi lên trên bề mặt thạch, có màu đen
Bước 4: Kiểm tra tính chất sinh hoá
Từ môi trường XLT4 và môi trường Rambach chọn ra khuẩn lạc điển hình kiểm tra đặc tính sinh hoá trên môi trường Kligler, ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng và cấy chích sâu ở phần thạch đứng xuống tận đáy ống nghiệm, để tủ ấm 37o
C/18-24 h, sau đó đọc kết quả:
+ Nếu phần thạch nghiêng có màu hồng: lactose âm tính. + Nếu phần thạch đứng có màu vàng: glucose dương tính. + Nếu có bọt khí: sinh hơi dương tính.
+ Nếu dọc đường cấy trích sâu có màu đen: H2S dương tính.
Những mẫu có phản ứng đặc trưng của vi khuẩn Salmonella trên môi trường Kligler (Lên men đường glucose, không lên men đường lactose, sinh hơi, H2S dương tính) được cấy kiểm tra vào: urease, LDC (nuôi cấy yếm khí) và Simmon,s citrate, để tủ ấm 37o
C/18-24 h đọc kết quả:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Simoncitrate: phần thạch nghiêng chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển.
+ Ure: dung dịch có màu đỏ nhạt chuyển sang mầu hồng rất đậm, ure dương tính.
Tiến hành định type theo bảng cấu trúc kháng nguyên của Kauffmann-White.