3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella trên vịt tại địa bàn nghiên cứu. - Xác tỷ lệ nhiễm Salmonella trên vịt theo mùa vụ.
- Nuôi cấy phân lập và xác định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng Salmonella phân lập được.
- Xác định type Salmonella phân lập được.
- Xác định kháng nguyên bám dính của các chủng Salmonella phân lập được. - Xác định khả năng sản sinh độc tố của các chủng Salmonella phân lập được. - Xác định độc lực các chủng Salmonella phân lập được.
- Xác định LD50 của các chủng Salmonella phân lập được từ vịt.
- Xác định khả năng gây bệnh của một số chủng Salmonella phân lập được. - Xác định khả năng kháng kháng sinh của một số chủng Salmonella
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Thử nghiệm một số phương pháp phòng trị bệnh do Salmonella gây ra trên vịt.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu bệnh phẩm: vịt con, vịt thịt và vịt đẻ bị tiêu chảy hoặc sắp chết hoặc chết nghi bệnh Phó thương hàn mổ khám tại chỗ, lấy bệnh phẩm (lách và manh tràng), bảo quản mẫu trong phích đá; vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm và tiến hành xét nghiệm; các mẫu chưa thực hiện xét nghiệm, được bảo quản lạnh 0 - 40C, nhưng không quá 24 giờ kể từ lúc thu thập. Mỗi loại bệnh phẩm được chứa riêng rẽ, ghi rõ số mẫu, địa chỉ, lứa tuổi vịt...
Mẫu trứng vịt trắng: mỗi trại lấy 15 quả trứng méo, dị hình, bảo quản về phòng thí nghiệm. Mỗi loại bệnh phẩm được chứa riêng rẽ, ghi rõ số mẫu, địa chỉ trại và lò ấp cung cấp...
Mẫu trứng chết phôi: lấy tại lò ấp, trước khi lấy hỏi rõ nguồn gốc, địa chỉ trại cung cấp trứng ấp. Lấy 20 quả trứng chết phôi từ mỗi trại, bảo quản cẩn thận mang về phòng thí nghiệm. Mỗi loại bệnh phẩm được chứa riêng rẽ, ghi rõ số mẫu, địa chỉ trại và lò ấp cung cấp...
Mẫu nước tại môi trường chăn nuôi: lấy khoảng 250 ml nước một cách ngẫu nhiên tại môi trường chăn nuôi vịt. Mỗi trại lấy 03 mẫu. Mỗi loại mẫu được chứa riêng rẽ, ghi rõ số mẫu, địa chỉ...
Mẫu thức ăn của vịt: lấy khoảng 100 gam thức ăn ở máng ăn, thức ăn là cua cá tại môi trường chăn nuôi vịt. Mỗi trại lấy 03 mẫu. Mỗi loại mẫu được chứa riêng rẽ, ghi rõ số mẫu, địa chỉ...
2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn theo ISO 6579
Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc.
Mẫu bệnh phẩm lách: lấy lách mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng rồi cân, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37o
C trong vòng 16-18 h.
Mẫu bệnh phẩm manh tràng: vô trùng bên ngoài manh tràng rồi dùng kéo và panh tuốt phân trong manh tràng cho vào túi dập mẫu vô trùng rồi cân, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37o
C trong vòng 16-18 h.
Mẫu là trứng vịt trắng và trứng chết phôi: lấy 25g mẫu (lấy phần lòng đỏ và phần noãn hoàng) cho vào túi dập mẫu vô trùng, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37o
C trong vòng 16-18h.
Mẫu là nước môi trường chăn nuôi: lấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37o
C trong vòng 16-18h.
Mẫu là thức ăn của vịt: lấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37oC trong vòng 16-18h.
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc.
Dùng pipet vô trùng hút 1-1,2ml dung dịch tăng sinh không chọn lọc, nhỏ 3 giọt vào thạch bán cố thể MSRV (để kiểm tra sự di động của vi khuẩn
Salmonella), để vào tủ ấm 41.50
C/24-48 h. Còn lại cho vào ống nghiệm có chứa 10 ml môi trường Muller Kauffmann, dùng máy (vortex) lắc đều, để vào tủ ấm 370
C/18-24 h.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
giọt canh khuẩn. Ở môi trường Muller Kauffmann hỗn dịch có thể biến đổi màu sắc.
Bước 3: Phân lập trên các môi trường chọn lọc
Dùng que cấy có đường kính 1μm lấy 1 vòng canh trùng từ môi trường MSRV (lấy ở vị trí vi khuẩn lan xa nhất) ria cấy sang đĩa thạch Rambach, để tủ ấm 370C/18 - 24 h. Khuẩn lạc Salmonella tròn trơn, nhẵn bóng, có màu đỏ hoặc hồng cánh sen.
Dùng que cấy có đường kính 10 μm lấy 1 vòng canh trùng từ ống tăng sinh Muller Kauffmann (trước khi lấy phải dùng máy lắc đều hỗn dịch trong ống) ria cấy sang đĩa thạch XLT4. Cấy làm 3 đường cấy và thưa dần để tách khuẩn lạc riêng rẽ. Để tủ ấm 370
C/18 - 24 h. Khuẩn lạc Salmonella tròn, bóng lồi lên trên bề mặt thạch, có màu đen
Bước 4: Kiểm tra tính chất sinh hoá
Từ môi trường XLT4 và môi trường Rambach chọn ra khuẩn lạc điển hình kiểm tra đặc tính sinh hoá trên môi trường Kligler, ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng và cấy chích sâu ở phần thạch đứng xuống tận đáy ống nghiệm, để tủ ấm 37o
C/18-24 h, sau đó đọc kết quả:
+ Nếu phần thạch nghiêng có màu hồng: lactose âm tính. + Nếu phần thạch đứng có màu vàng: glucose dương tính. + Nếu có bọt khí: sinh hơi dương tính.
+ Nếu dọc đường cấy trích sâu có màu đen: H2S dương tính.
Những mẫu có phản ứng đặc trưng của vi khuẩn Salmonella trên môi trường Kligler (Lên men đường glucose, không lên men đường lactose, sinh hơi, H2S dương tính) được cấy kiểm tra vào: urease, LDC (nuôi cấy yếm khí) và Simmon,s citrate, để tủ ấm 37o
C/18-24 h đọc kết quả:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Simoncitrate: phần thạch nghiêng chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển.
+ Ure: dung dịch có màu đỏ nhạt chuyển sang mầu hồng rất đậm, ure dương tính.
Tiến hành định type theo bảng cấu trúc kháng nguyên của Kauffmann-White.
2.3.3. Phương pháp giám định các đặc tính sinh hoá
Kiểm tra đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Salmonella trên môi trường
thạch TSI, bằng cách ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng và cấy trích sâu một đường xuống đáy ống nghiệm, để tủ ấm 370C trong 24 giờ sau đó xem kết quả: bề mặt ống nghiệm có màu hồng, đường cấy trích sâu có màu đen do sản sinh H2S. Những ống có phản ứng đặc trưng của vi khuẩn Salmonella sẽ được dùng để kiểm tra các phản ứng sinh hoá.
2.3.3.1. Phản ứng chuyển hoá đường: môi trường pepton
+ Thành phần: H2O: 1000 ml; Pepton: 15 g; Andre: 10 ml.
+ Cách pha: trộn đều hỗn hợp trên, đun cho tan hết rồi cho vào mỗi ống 1 ống Ampul. Hấp vô trùng 1210C trong 15 phút, để nguội. Dùng pipet vô trùng nhỏ vào mỗi ống 5-6 giọt đường (mỗi ống 1 loại đường). Kiểm tra vô trùng trong tủ ấm ở 370
C trong 24h. Sau đó nhỏ 5 - 6 giọt canh trùng để tủ ấm 370C trong 24 giờ.
+ Đọc kết quả.
- Nếu vi khuẩn lên men sinh hơi thì đẩy ống Ampul lên.
- Nếu vi khuẩn không lên men đường, môi trường không đổi màu. - Nếu vi khuẩn lên men đường, môi trường đổi màu sang màu đỏ.
2.3.3.2. Phản ứng Indole (dùng thuốc thử Kavac)
+ Phương pháp tiến hành: cấy vi khuẩn vào môi trường nước thịt để ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ, sau đó nhỏ từ từ vào thành ống nghiệm 4-5 giọt thuốc thử Kovac.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Đọc kết quả: Salmonella phản ứng sinh Indol âm tính nên bề mặt môi trường không có màu đỏ đậm.
2.3.3.3. Phản ứng sinh H2S
+ Phương pháp làm: dùng que cấy đầu nhọn vô trùng lấy vi khuẩn rồi cấy trích sâu vào môi trường TSI agar để tủ ấm 370C trong 24 giờ. Nếu vi khuẩn sinh H2S thì dọc theo đường cấy sẽ xuất hiện màu đen.
2.3.3.4. Phản ứng Catalase và Oxidase
Đây là 2 phản ứng thực hiện nhanh với khuẩn lạc thu được từ thạch đĩa. + Phản ứng Catalase:
- Phương pháp tiến hành thử như sau:
Lấy một phiến kính sạch, dùng que cấy cẩn thận lấy một phần của khuẩn lạc đặt lên giữa phiến kính. Nhỏ một giọt hydrogen peroxidaza (H2O2) lên vùng có khuẩn lạc. Phản ứng được cho là dương tính nếu ngay sau khi nhỏ chất phản ứng, bọt khí được hình thành. Ngược lại không có bọt khí hình thành, kết quả âm tính.
+ Phản ứng Oxidase:
Phản ứng này phụ thuộc vào sự có mặt của các men chứa sắt có trong vi khuẩn. Kết quả làm chuyển nhanh tác nhân của phản ứng từ không màu chuyển sang màu tím đậm trong vòng 10 giây. Nếu thời gian chuyển màu dài hơn, kết quả âm tính. Tác nhân của phản ứng có thể làm khô trên một miếng giấy lọc sạch và khuẩn lạc được nhặt ra và phiết lên. Màu tím xuất hiện sau vài giây thực hiện, phản ứng cho kết quả dương tính.
2.3.4. Xác định type của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kháng huyết thanh đơn giá O, H của hãng SIFIN (Đức) và Bio RAD (Pháp).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sử dụng khay thuỷ tinh trong đó có các giếng nhỏ. Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh vào giếng, dùng que cấy vô trùng lấy 1 phần khuẩn lạc cần định type từ thạch nuôi cấy, trộn đều khuẩn lạc và kháng huyết thanh, lắc nhẹ và quan sát:
+ Phản ứng dương tính: có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti. + Phản ứng âm tính: huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đồng nhất không có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi đục.
Đối với các chủng sau khi định được kháng nguyên O, H1 mà chưa định được type thì phải xác định pha 2 của kháng nguyên H. Sau khi xác định kháng nguyên H pha 1 theo sơ đồ trên, tiến hành xác định pha 2 như sau:
- Chuẩn bị thạch Sven Gard: đây là môi trường bán cố thể, có bán sẵn trên thị trường, chỉ cần pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dùng đĩa có đường kính 6cm. trước khi đổ thạch nhỏ 1 giọt nhỏ Anti Sven Gard Serum với mục đích ức chế pha 1.Tuỳ theo pha 1 mà có loại Anti Sven Gard Serum khác nhau ví dụ SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6.
- Sau khi đã có thạch Sven Gard, dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn đã xác định được kháng nguyên H pha 1, chấm nhẹ lên bề mặt thạch ở giữa đĩa thạch.
- Nuôi ở 37oC/24h.
- Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính tương tự như đối với pha 1.
* Xác định type Salmonella bằng kháng huyết thanh theo Kauffmann- White (Salmonella serotyping following Kauffmann Scheme) (năm 1972).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.1: Bảng định type huyết thanh học của vi khuẩn Salmonella theo Kauffmann-White (1972) [59]
Nhóm Type Kháng nguyên O Kháng nguyên H
Pha 1 Pha 2 A S. paratyphi A 1,2,12 a [1,5] B S. derby 1,4,[5],12 f,g [1,2] S. typhimurium 1,4,[5],12 i 1,2 S. saintpaul 1,4,[5],12 e,h 1,2 S. agona 1,4,[5],12 f,g,s [1,2] S. paratyphi B 1,4,[5],12 b 1,2 S. london 4,12 e,h 1,6 C1 S. paratyphi C 6,7,[Vi] c 1,5 S. cholerae suis 6,7 c 1,5 S. rissen 6,7,14 f,g - D S. typhi 9, 12 (Vi) d - S. enteritidis 1, 9, 12 g, m [1, 7] 2.3.5. Xác định khả năng sản sinh độc tố
2.3.5.1. Phương pháp xác định kháng nguyên bám dính của vi khuẩn Chuẩn bị kháng nguyên Chuẩn bị kháng nguyên
Rửa các chủng vi khuẩn trên bề mặt các môi trường thạch đĩa bằng dung dịch nước muối sinh lý 0, 85%, thu lấy huyễn dịch vi khuẩn. Hoặc canh khuẩn được bồi dưỡng có lắc để đạt khoảng 108
vi khuẩn/ml, bảo quản huyễn dịch thu được ở 40
C.
Máu cừu khoẻ mạnh được lấy vào bình có Citrat natri, máu được rửa 3 lần bằng dung dịch Phosphat buffer Saline (PBS) bằng cách ly tâm 3000 vòng/phút với thời gian 30 phút. Sau lần rửa thứ 3 gạn bỏ phần nước trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trên và giữ hồng cầu, bảo quản ở 40C. Khi tiến hành phản ứng, pha hồng cầu gà với nước muối sinh lý thành nồng độ 3%.
Đối với vi khuẩn Salmonella, kháng nguyên bám dính là CFA1, để tiến hành phản ứng này dùng hồng cầu gà.
Tiến hành phản ứng
Phản ứng được thực hiện trên khay Takashi (khay nhựa 96 lỗ), các bước tiến hành như sau:
+ Bước 1: Dùng Micropipet nhỏ vào mỗi giếng 0,025 ml dung dịch
nước muối sinh lý 0,85%.
+ Bước 2: Cho vào lô thứ nhất 0,025 ml canh khuẩn chuẩn bị ở trên rồi
pha huyễn dịch vi khuẩn theo hệ số 2: (1/2, 1/4, 1/8, 1/16…) ở 8 lỗ hàng cuối cùng không pha, để nguyên nước muối sinh lý làm đối chứng).
+ Bước 3: cho vào mỗi lỗ huyễn dịch trên 0, 025 ml dịch máu cừu hoặc
gà nồng độ 3%.
Lắc nhẹ nhàng khay nhựa cho các thành phần hoà trộn đều vào nhau, đậy kín khay và cho vào ở 40
C, sau 2- 4 giờ đọc kết quả.
Đánh giá kết quả thu được
Phản ứng dương tính: khi xuất hiện ngưng kết hồng cầu, đánh giá theo 4 cấp độ sau:
(+) : khi có khoảng 25% lượng hồng cầu ngưng kết ở dưới (++) : khi có khoảng 50% lượng hồng cầu ngưng kết ở dưới (+++) : khi có khoảng 75% lượng hồng cầu ngưng kết ở dưới (++++): khi 100% lượng hồng cầu ngưng kết ở dưới
Phản ứng đánh giá âm tính: khi không có hiện tượng ngưng kết trên và giống như đối chứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.5.2. Xác định độc tố của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được bằng phương pháp khuếch tán trên da thỏ
Phương pháp (Intradermal Test) được thực hiện và đánh giá theo Sanderfur và Peterson (1997)[73].
Vi khuẩn Salmonella cần xác định độc tố được cấy trong môi trường BHI bồi dưỡng ở 37oC có lắc (cấy vào bình 100ml với lượng môi trường 20 - 30ml).
- Sau 3 giờ nuôi cấy cho vào một lượng lincomycin, sao cho nồng độ kháng sinh cuối cùng trong môi trường đạt 0,5 mg/ml.
- Sau 24 giờ nuôi cấy canh trùng đem ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút bỏ cặn lấy nước trong và chia làm 2 phần.
+ Phần bảo quản ở 4oC để thử độc tố không chịu nhiệt.
+ Phần đun cách thủy 80oC trong 30 phút rồi bảo quản ở 4oC để thử độc tố chịu nhiệt.
- Thỏ lớn, trọng lượng 2,8 - 3kg được cắt lông phần lưng bằng kéo cong, dùng kem rụng lông bôi sau 10 phút gạt sạch kem, lau khô da (chú ý không làm trầy, xước da).
Dùng bút dạ chia phần lưng thỏ trụi lông thành ô vuông, mỗi ô có cạnh 2cm. Tiêm trong da ở giữa ô 0,1ml dung dịch độc tố của chủng đã chuẩn bị ở trên, mỗi mẫu tiêm 2 ô ở vị trí cách xa nhau. Đối chứng âm trên 0,1ml môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn.
- Sau khi tiêm 2 giờ (với thỏ tiêm độc tố đã đun ở 80oC) và sau 18 giờ (với thỏ tiêm độc tố không đun) bắt thỏ tiêm tĩnh mạch 3 - 5 ml dung dịch Evanblue đủ lượng 40 mg/kg thể trọng.
- Thỏ được nuôi tiếp 2 giờ và đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính: diện tích da thỏ quanh chỗ tiêm khoảng 4 x