3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.2.8. Đặc điểm nuôi cấy
Pasteurella multocida là loại vi khuẩn sống hiếu khí hay yếm khí tuỳ
tiện, rất dễ nuôi cấy trong các môi trường nhân tạo với độ pH = 7,2 - 7,4, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp 37 - 38o
C trong tủ ấm.
Vi khuẩn P. multocida phát triển tốt trong hầu hết các loại môi trường dinh dưỡng thông thường. Môi trường dùng để nuôi cấy P. multocida có thể là môi trường đặc, lỏng hoặc bán lỏng.
Theo Namioka và Murata (1961a)[75] cho biết môi trường phân lập
P.multocida là môi trường thạch có thêm 5 - 10%huyết thanh thỏ hoặc ngựa.
Còn môi trường nuôi cấy và thu hoạch kháng nguyên là môi trường YPC thạch. Khi giữ giống tươi thì có thể dùng môi trường này đậy nút kín để ở 4o
C giữ được 2 - 3 tuần. Để đông khô giữ giống thì dùng môi trường YPC không cho thạch mà thêm Sucrose 1,0 g, sodium glutamic 1,0 g. Giống vi khuẩn trong ống đông khô có thể giữ được 10 năm.
Nuôi cấy vi khuẩn P. multocida trên môi trường thạch máu sẽ ức chế xuất hiện các biến thể. Một số nghiên cứu còn cho thấy có thể thay thành phần máu bằng các chất khác như Haematin, Catalase, Sodium sulfite và một số chất khác có đặc tính xúc tác phân hủy H2O2. Vi khuẩn P. multocida cũng mọc tốt trong môi trường nước thịt, sau 24h làm đục môi trường và canh trùng thuần khiết có mùi tanh đặc trưng, vài ngày sau nước thịt trở nên trong, đáy có cặn nhày, lắc khó tan, trên mặt môi trường có lớp màng mỏng khi lắc lớp màng này vỡ ra. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn là 37O
C, pH trong khoảng 7,2 - 7,4. Trong môi trường nuôi cấy nếu có thêm huyết thanh hoặc máu thì vi khuẩn sẽ mọc tốt hơn.
Peter và cs (1996)[80] sử dụng môi trường dinh dưỡng tối thiểu nuôi cấy chủng sinh độc tố và không sinh độc tố của P. multocida. Môi trường này gồm 17 thành phần, trong đó có cystein, glutamic acid, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine, đường…
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trong đó leucine có tác dụng kích thích tăng trưởng và thiamine có thể thay thế bằng adenine (Jablonski và cs, 1996)[69].
Trong các loại môi trường dùng để bảo quản mẫu bệnh phẩm chứa
P.multocida thấy vi khuẩn này có thể duy trì sự sống được trong môi trường
Cary - Blair và L-15 (Leubovitz medium No 15) hơn 15 ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng, tuy nhiên sử dụng Cary-Blair làm môi trường vận chuyển (transport medium) thì sẽ tốt hơn, còn môi trường L-15 thích hợp hơn khi bảo quản vi khuẩn này trong phòng thí nghiệm (Eiichi, 1997)[60].
Khi nghiên cứu các dạng khuẩn lạc của P. multocida cho thấy chủ yếu hai dạng là dạng có dung quang màu xanh và dạng có dung quang sắc cầu vồng. Những khuẩn lạc có dung quang màu xanh thường không có hoặc ít có giáp mô, vì thế không có độc lực hoặc độc lực thấp. Các chủng cường độc hoặc mới phân lập có dung quang mạnh. Khi tiêm truyền các chủng P. multocida qua bồ câu thấy có sự tăng lên của những vi khuẩn tạo khuẩn lạc
dạng S (Smooth).
- Môi trường thạch thường: Sau 24 giờ nuôi cấy P. multocida phát triển thành khuẩn lạc nhỏ long lanh như hạt sương, để lâu ngày thì kích thước khuẩn lạc sẽ lớn hơn. Khi cấy chuyển nhiều lần giáp mô bị mất, kích thước khuẩn lạc sẽ nhỏ lại. Trên môi trường thạch vi khuẩn phát triển thành 3 dạng khuẩn lạc:
+ Dạng S (Smooth) là dạng thường thấy, khuẩn lạc nhỏ, bóng láng long lanh, mặt vồng, có dung quang sắc cầu vồng, khuẩn lạc có huỳnh quang, có tính kháng nguyên và độc lực cao. Vi khuẩn thuộc dạng khuẩn lạc này thường tạo thành lớp giáp mô.
+ Dạng R (Rough): Là dạng biến dị, khuẩn lạc thường to dẹt, rìa nhám xù xì, có dung quang màu xanh lơ, có tính kháng nguyên và độc lực thấp.
+ Dạng M (Mucoid): Là dạng biến dị, khuẩn lạc nhày ướt, rìa nhẵn, có kích thước to nhất, dung quang sắc cầu vồng yếu hơn ở dạng S và độc lực thấp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tính biến dạng của vi khuẩn này rất lớn khi nuôi cấy chuyển qua môi trường dinh dưỡng nhiều lần hoặc tiêm qua động vật, từ dạng S chúng có thể chuyển thành dạng M hoặc R và ngược lại.
- Trên môi trường thạch máu: Vi khuẩn phát triển mạnh không làm dung huyết, khuẩn lạc phát triển mạnh hình tròn to có kích thước lớn hơn thạch thường, có màu xanh tro nhạt hình giọt sương và có mùi tanh nước rãi khô rất đặc trưng. Đặc điểm này dễ nhận ra và được nhiều tác giả công nhận như một đặc điểm để chẩn đoán.
- Trên môi trường thạch có bổ xung huyết cầu và huyết thanh: Đây là môi trường đặc biệt dùng để phân lập, giám định và xác định độc lực của vi khuẩn, ở môi trường này vi khuẩn P. multocida phát triển thành khuẩn lạc đặc biệt có hiện tượng phát dung quang khi quan sát vi khuẩn trên kính hiển vi độ phóng đại 20 lần và góc chiếu sáng phản quang của ánh sáng đèn điện là 45o
. Màu sắc phát quang của khuẩn lạc phụ thuộc vào độc lực của vi khuẩn: vi khuẩn có độc lực cao màu xanh lá mạ chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc, còn 1/3 diện tích khuẩn lạc có màu vàng da cam, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent). Vi khuẩn có độc lực trung bình thì diện tích khuẩn lạc có màu xanh lá mạ ít hơn diện tích màu vàng da cam, khuẩn lạc này gọi là Fo (Orange Fluorescen), còn vi khuẩn có độc lực yếu, khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phát quang, gọi là Nf (Not Fluorescent).
Vi khuẩn P. multocida khi mới phân lập từ bệnh phẩm, tổ chức hoại tử bắt màu lưỡng cực và có giáp mô nếu có dung quang mạnh. Các tính chất này sẽ thay đổi cùng với số lần cấy chuyển trên môi trường nhân tạo, nhưng sẽ được phục hồi khi tiêm truyền qua động vật thí nghiệm hoặc động vật mẫn cảm.
Một tính chất quan trọng là hình thái và màu sắc cầu vồng của khuẩn
lạc P. multocida nhìn qua ánh sáng điện xiên 45o: Khi mới phân lập, khuẩn
lạc có cầu vồng mạnh hoặc yếu hay có hình rẻ quạt với màu biến đổi hoặc khuẩn lạc có màu xanh ít hay không màu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Màu của khuẩn lạc P. multocida thường liên quan đến giáp mô của vi khuẩn. Từ dạng có giáp mô trong canh khuẩn tươi, khuẩn lạc có dung quang, sau vài lần nuôi cấy giáp mô mất dần, khuẩn lạc nhỏ và dung quang kém, khi khuẩn lạc chứa chất nhày thì dung quang càng kém hơn, độc lực của vi khuẩn giảm dần từ dạng S đến dạng R.
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn P. multocida phát triển thành những khuẩn
lạc đặc biệt, có hiện tượng phát huỳnh quang khi quan sát bằng kính hiển vi với ánh sáng đèn điện góc chiếu phản quang là 45o
thấy có 3 loại khuẩn lạc. Tùy theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc của khuẩn lạc khác nhau.
Loại Fg (Greenish fluorescent): 2/3 khuẩn lạc có màu xanh lơ, 1/3 có màu da cam, khuẩn lạc hình tròn, rìa gọn, mặt vồng và có độc lực cao.
Loại Fo (Orange fluorescent): màu xanh lơ ít và vàng da cam nhiều, những khuẩn lạc này độc lực tương đối yếu.
Loại Nf (Not fluorescent): khuẩn lạc độc lực yếu nhất, không màu, không có huỳnh quang, khuẩn lạc dạng S, nhỏ, trong.
Cách xem huỳnh quang của khuẩn lạc trên chỉ áp dụng cho Pasteurella
gây bệnh ở lợn và trâu bò, nhưng không áp dụng cho Pasteurella gây bệnh ở gia cầm. Pasteurella aviseptica gây bại huyết, xuất huyết cho gia cầm có độc lực mạnh nhưng khuẩn lạc của chúng thuộc loại Fo.
Hiện tượng phát huỳnh quang của khuẩn lạc xem rõ khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thạch trong sáng, khuẩn lạc cách xa nhau sau 24 giờ, nếu để lâu sau 72 giờ thì huỳnh quang sẽ mất đi. Vi khuẩn loại Fg có thể biến dị thành vi khuẩn dạng Fo hay loại Nf, đi đôi với sự biến dị của khuẩn lạc thì độc lực của vi khuẩn cũng phát sinh biến dị.
- Môi trường Gelatin: Hình thành khuẩn lạc mịn, hình hạt dọc theo đường cấy chích sâu, không làm gelatin tan chảy.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Môi trường huyết thanh đông: Vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc hình giọt nước nhỏ, trong suốt trên mặt thạch.
- Môi trường cho thêm Neomycine 2,5 mg/lit, có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của P. pseudotubeculosis và cho phép P. multocida phát triển. Trên môi trường thạch huyết cầu tố và huyết thanh vi khuẩn mọc tốt hơn (Nguyễn Vĩnh Phước, 1964)[22]. Trong môi trường nước thịt Hottinger hoặc Martin sau khi nuôi cấy 24 giờ, vi khuẩn phát triển làm môi trường đục nhẹ, khi lắc nhẹ có vẩn như sương mù sau đó mất, nếu để quá 24 giờ dưới đáy có lắng cặn nhày và bên trên có màng mỏng (Cater, 1967)[52]. Theo Rhoades và cs (1992)[82] hình thái kích thước của P. multocida thường thay đổi trong quá trình nuôi cấy, nếu nuôi cấy trong những điều kiện không thuận lợi hoặc cấy chuyển nhiều lần trên môi trường thì tế bào vi khuẩn sẽ có kích thước nhỏ lại và có hình thái đa dạng. Thomson và cs (1992)[90] cho biết môi trường Bactotryptose ở 15oC và 37oC trong vài tháng vi khuẩn vẫn còn sinh độc tố. Một số chủng P. multocida còn có pili trên bề mặt, vai trò của những cấu trúc này trong việc bám dính đã được nghiên cứu, đa phần các vi khuẩn
P.multocida gây bệnh viêm teo mũi lợn có pili (chiếm 60 - 80%), tuy nhiên
khi cấy các vi khuẩn này ở invitro thì số lượng vi khuẩn có pili giảm đi rất nhiều, chỉ còn từ 3 - 5% (Richard và Emilio, 1995)[83].
Theo Hoàng Đạo Phấn (1996)[20] để giữ giống P.multocida tươi cần
cấy chuyển vi khuẩn qua thạch máu vì vi khuẩn mới được phân lập mọc tốt trong các môi trường nuôi cấy thông thường nhưng khi nuôi cấy chuyển tiếp sẽ mọc yếu, vì vậy phải cho thêm hồng cầu vào môi trường nuôi cấy. Nếu phân lập trong bệnh phẩm thì P. multocida thường có hình trứng, hình cầu,
trực khuẩn hoặc hình thành chuỗi ngắn. Nuôi cấy trong môi trường nhân tạo trước 24 giờ, P. multocida có dạng cầu khuẩn đứng riêng rẽ hay thành đôi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Ngoài ra, hình thái của P. multocida còn thay đổi tùy theo sự hình
thành giáp mô, kích thước của vi khuẩn có giáp mô thường lớn hơn vi khuẩn không có giáp mô. Vi khuẩn thoái hóa nhanh sau khi phân lập và nuôi giữ trên môi trường dinh dưỡng, khi nuôi cấy trên môi trường thạch thường ở 37oC sau 24 giờ P. mutocida phát triển thành khuẩn lạc nhỏ long lanh như hạt sương, hơi lồi ở giữa, để lâu khuẩn lạc to màu trắng đục.
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn P. multocida để làm vac-xin người ta thường sử dụng môi trường cơ bản có thêm Saccarore, peptone và chất chiết men bia. Môi trường Hottinger cũng tốt cho P. multocida phát triển. Nuôi cấy có sục khí (aeration) có thể làm tăng sinh khối vi khuẩn lên gấp 20 lần so với nuôi cấy tĩnh. Sục khí bằng hỗn hợp khí có tỷ lệ CO2 và O2 khác nhau cũng tác dụng như sục khí bằng không khí thông thường, nhưng nếu sục khí bằng oxy nguyên chất sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Nuôi cấy động trên máy lắc vi khuẩn cần 12 giờ để đạt đến pha dừng, còn nuôi cấy sục khí khuấy đảo liên tục trong fermentor bằng công nghệ lên men hiện đại thì chỉ cần 5 giờ đã đạt mức phát triển tối đa. Trong môi trường Hottinger có bổ xung thêm đường, tụy đệm thì vi khuẩn P. multocida chủng P52 phát triển mạnh và có thể đạt tới nồng độ 50 tỷ CFU/ml (Trần Đình Từ và cs, 2000)[38].
Nếu nuôi cấy tĩnh P. multocida sẽ phát triển theo 4 pha phát triển chậm (pha thích nghi) kéo dài từ khi nuôi cấy đến giờ thứ 8, pha phát triển (pha logrit) bắt đầu từ giờ thứ 8 đến 14, pha cân bằng bắt đầu từ giờ 14 đến giờ 19, sau đó là pha suy tàn.
Trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, các gen liên quan tới quá trình trao đổi chất của vi khuẩn hoạt động mạnh (Shivachandra và cs, 2006)[88].
Một số phòng thí nghiệm đã thử nghiệm nuôi cấy P. multocida trong nhiều loại môi trường có thêm một số chất, kết quả thu được rất đáng khích lệ,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tuy nhiên chất lượng vi khuẩn (kháng nguyên) nuôi cấy trong các môi trường khác nhau thì có thể khác nhau. Nồng độ vi khuẩn trong một số môi trường rất cao nhưng hoạt tính huyết thanh học của vi khuẩn có thể bị thay đổi.