3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.3.7. Các loại hóa chất dùng cho nghiên cứu
+ Các loại hóa chất dùng để sát trùng, tiêu độc: KMnO4, NaOH, Formaldehyt 36 - 38%.
+ Dung dịch PBS, chỉ thị màu Andrade, thuốc nhuộm Gram.
2.3.8. Môi trƣờng sử dụng và nuôi cấy vi khuẩn
+ Môi trường nước thịt + Môi trường thạch thường. + Môi trường thạch máu. + Môi trường Mac Conkey
+ Bộ môi trường 3 ống nghiệm của Lassen (1975)[71]
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phƣơng pháp điều tra dịch tễ bệnh THT lợn
Điều tra tình hình dịch tễ bệnh tụ huyết trùng lợn từ năm 2006 - 2008 tại các địa phương nghiên cứu của tỉnh Phú Thọ bằng phương pháp hồi cứu của Nguyễn Như Thanh (2001).
2.4.2. Phƣơng pháp lấy mẫu
+ Với lợn khỏe: Dùng tăm bông y tế vô trùng ngoáy sâu vào mũi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
số thứ tự. Mẫu được bảo quản trong đá lạnh ở nhiệt độ từ 2 - 8o
C và đưa về phòng thí nghiệm.
+ Với lợn chết nghi mắc bệnh: Lấy họng, phủ tạng (phổi, hạch
phổi), máu, xương ống cho vào bảo quản trong đá lạnh ở nhiệt độ từ 2 - 8o C và đưa về phòng thí nghiệm.
2.4.3. Phƣơng pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn
Mỗi mẫu sau khi lấy về được nuôi cấy trên các môi trường thông thường và đặc biệt như nước thịt, thạch máu, thạch Mac Conkey. Nuôi cấy trong thời gian 18-24 giờ ở 37o
C. Sau khi vi khuẩn mọc, căn cứ vào tính chất mọc trên các môi trường để chọn các khuẩn lạc điển hình của
Pasteurella. Sau đó nuôi cấy lại vi khuẩn trên các môi trường chọn lọc
cho thuần khiết rồi tiến hành các phương pháp thử sinh hóa để giám định vi khuẩn. Khuẩn lạc P. multocida được chọn theo tiêu chuẩn của Hedleston (1966)[65], Carter (1984)[54].
Căn cứ vào tiêu chuẩn Carter (1984)[54] để phân biệt từng loại vi khuẩn, cấy Pasteurella lên thạch máu ống, thạch huyết thanh để tiến hành các phản ứng sinh hóa học.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
SƠ ĐỒ QUY TRÌNH NUÔI CẤY, PHÂN LẬP P. MULTOCIDA
(Viện Thú y Quốc gia, năm 2004)
Và lưugiữ Mẫu bệnh phẩm
Nuôi cấy trên các môi trường nước thịt, thạch máu, MacConkey… Chọn khuẩn lạc đặc trưng Kiểm tra hình thái trên kính hiển vi Tiêm truyền qua chuột bạch Giám định vi khuẩn Kiểm tra hình thái Kiểm tra các đặc tính sinh hóa Kiểm tra khả năng lên men đường Kiểm tra độc lực Định type huyết thanh học Bảo quản và lưu giữ giống
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.4. Phƣơng pháp xác định một số đặc tính sinh vật, hoá học của vi khuẩn P. multocida
* Thử phản ứng Oxidaza
Phản ửng được tiến hành trên giấy thấm dung dịch Tetramethyl Phenylene. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Nếu chỗ được bôi khuẩn lạc sau 10 giây xuất hiện màu đen tím là phản ứng dương tính. Nếu không xuất hiện màu đen tím hoặc không đổi màu là âm tính.
* Thử phản ứng Catalaza
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên mặt phiến kính sạch, nhỏ dung dịch H2O2 3-5% lên, trộn đều. Nếu có hiện tượng sủi bọt là dương tính.
* Thử phản ứng lên men đường
Cấy vi khuẩn vào môi trường nước thịt pepton đã có 1% đường và chất chỉ thị màu Andrade, để vào tủ ấm 37OC sau 24 giờ rồi đọc kết quả.
Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển màu đỏ, phản ứng âm tính khi môi trường không chuyển màu.
* Thử phản ứng phân hủy Urea
Các giống vi khuẩn cần thử vào ống môi trường ure và bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370
C, sau 4 - 24 giờ thì đọc kết quả. Nếu dung dịch có màu hồng là phản ứng dương tính, dung dịch không chuyển màu là phản ứng âm tính.
2.4.5. Phƣơng pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn P. multocida phân lập đƣợc
2.4.5.1. Kiểm tra độc lực của P. multocida trên chuột bạch (theo phƣơng
pháp Carter (1984)[54])
Để kiểm tra và xác định độc lực của vi khuẩn P. multocida phân lập được, chúng tôi dùng phương pháp tiêm truyền qua chuột bạch (trọng lượng 18 -20 gam/con).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Vi khuẩn từ môi trường giữ giống đem cấy vào môi trường nước thịt thường, bồi dưỡng ở 370C/24 giờ. Canh trùng được tiêm vào xoang phúc mạc chuột bạch, mỗi chuột 0,2 ml, mỗi chủng vi khuẩn được thử trên 2 chuột, theo dõi triệu chứng và thời gian chết trong 7 ngày. Chuột chết mổ khám kiểm tra bệnh tích và phân lập lại được vi khuẩn thuần khiết thì kết luận chuột thí nghiệm chết do vi khuẩn gì.
2.4.5.2. Phương pháp thử kháng sinh đồ
Các chủng Pasteurella phân lập được xác định tính mẫn cảm kháng sinh theo phương pháp của Nguyễn Thanh Hà (1991)[6].
Chuẩn bị canh trùng: Các chủng P. multocida được cấy vào môi trường BHI, bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ. Dùng pipet Pasteur lấy 0,1- 0,2 ml canh trùng, nhỏ 3-5 giọt vào đĩa thạch, láng đều, để 3-5 phút cho khô mặt thạch. Dùng panh đặt và ấn nhẹ các giấy đã tẩm các loại kháng sing lên mặt thạch đặt cách nhau 20mm. Sau 15 phút thì lật úp đĩa thạch vào tủ ấm 37OC. Đọc kết quả và đánh giá khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn. Trong nghiên cứu này chúng tôi dùng giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) sản xuất, Code 1332 E. Kết quả đánh giá theo bảng hướng dẫn của nhà sản xuất.
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa và đánh giá theo bảng hướng dẫn của nhà sản xuất.
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa và đánh giá kết quả theo Hội đồng Quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn * Phương pháp tiến hành như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hinton.
+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môit trường thạch máu ở 37oC. Lấy 1 khuẩn lạc hòa vào 1,5ml nước sinh lý để đạt được độ đục 0,5 trong dãy so màu Mc Farland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều trên thạch đĩa Muller Hinton.
+ Bước 3: Dùng máy tự động đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) sản xuất lên mặt đĩa thạch.
+ Bước 4: Bồi dưỡng đĩa thạch ở 37o
C trong 18 - 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra.
Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh
(Theo tiêu chuẩn của Hội đồng Quốc gia Hoa kỳ -1999)
Kháng sinh Vòng vô khuẩn (đƣờng kính mm) Kháng Mẫn cảm trung bình Mẫn cảm Trimethoprim- Sulphamethoxazole 10 11-15 16 Streptomycin 11 12-14 15 Gentamycin 12 13-17 18 Neomycin 12 13-14 15 Cephalothin (KF 30) 14 15-17 18 Amikacin (AK 30) 14 15-16 17 Apramycin (APR 15) 10 11-14 15 Ceftiofur (EFT 30) 17 18-20 21 Lincospectinomycin 10 11-13 14 Nofloxacin 16 17-19 20 Ampicillin 11 12-14 15 Tetracyclin 14 15-18 19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.6. Phƣơng pháp xác định type kháng nguyên của P. multocida
Dùng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) để xác định serotype những chủng P. multocida theo Townsend (1998)[91].
Phản ứng REP - PCR (Repetive Extragentic Palindronic) theo phương pháp của Townsend (1998) [91] dùng để xác định dưới type và phân biệt sự khác nhau giữa các chủng phân lập được lập theo cấu trúc gen.
Phản ứng PCR được tiến hành nhờ Taq AND polymerase dùng dung dịch đệm và hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR và cặp mồi:
Buffer (10 x PCR) Gibco BRL, Life Technologies
Buffer (10 x PCR) Perkin Elmer, Roche
Taq DNA Polymerase, recombinant Gibco BRL, Life Technologies Taq DNA Polymerase Perkin Elmer, Roche
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs ) Gibco BRL, Life Technologies Agarose (Ultra pure DNA grade) Gibco BRL, Life Technologies
Agarose (DNA grade) Bio RAD
Agarose (DNA grade) Progen
Ethidium bromide (EtBr) Bio RAD Molecular weight marker (GeneRuler TM) Progen
Photographic fiml Polaroid
PM-PCR: KMT1T7 5’- ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’ KMT1SP6 5’- GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’ Townsend và cs (1998) [91] HSB-PCR: KTT72 5’- AGGCTCGTTTGGATTATGAAG-3’ KMT1SP6 5’- ATCCGCTAACACACTCTC-3’ Townsend và cs (1998) [91]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phản ứng PCR gồm có các giai đoạn: tiền biến tính ở 94o
C/3 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính 94o
C/1 phút, ủ bắt cặp 55oC/1 phút, kéo dài ở 72oC/1 phút) và kéo dài cuối cùng ở 72o
C/7 phút.
Quá trình điện di được thực hiện trên gen agarose 2%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Gel được nhuộm trong dung dịch EDTA đã bổ xung 1% ethidium bromide. Sau 15 phút, tiến hành đọc kết quả bằng hệ thống Gel-Doc 2000. Các vạch DNA được đánh giá bằng cách so sánh với DNA ladder chuẩn và mẫu đối chứng dương.
Để thực hiện hai phản ứng trên: một khuẩn lạc vi khuẩn P.multocida
cân nghiên cứu từ thạch máu, hòa tan trong dung dịch khuếch đại PCR. Các phản ứng khuếch đại sử dụng PCR được thực hiện ở thể tích cuối cùng là 25l, trong đó: 0,125mM của từng loại mồi, 200mM của từng dNTP (dTTp, dATP, dGTP, dCTP) dung dịch đệm PCR 1 x cùng với 2 mM MgCl2 và 0,5 Uta DNA Polymerase. Dùng cho REP - PCR, các phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy PCR với các điều kiện chu trình cho 2 phản ứng trên có khác nhau. Sản phẩm sau phản ứng PCR được chạy điện di trên gel trên gel Agarose 2% trong TAE 1X có 1 mg/ml Ethidium bromide với điện trường 2,5 V/cm trong 3 giờ. Các đoạn DNA (sản phẩm của PCR) được xem bằng máy chiếu tia cực tím (UV Transilluminator) và chụp hình bằng polaroid. Đối với PCR mẫu được coi là dương tính khi có bán sản phẩm (DNA) chuẩn 100bp. Đối với REP - PCR các mẫu được so sánh với nhau bằng các sản phẩm DNA khác nhau được tạo ra có kích thước khác nhau khi so sánh với thang chuẩn.
2.4.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được trong các thí nghiệm được sử lý theo phương pháp toán học thông thường, phương pháp thống kê sinh học của Nguyễn Văn Thiện (1997)[34].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả điều tra tình hình dịch bệnh tụ huyết trùng lợn tại các huyện nghiên cứu ở tỉnh Phú Thọ nghiên cứu ở tỉnh Phú Thọ
3.1.1. Kết quả điều tra bệnh tụ huyết trùng ở lợn tại tỉnh Phú Thọ qua các năm 2006 - 2008 các năm 2006 - 2008
Thời tiết các tỉnh miền núi phía Bắc nói chung, tỉnh Phú Thọ nói riêng có sự biến động lớn về nhiệt độ và ẩm độ, trong đó có hai mùa rõ rệt là mùa mưa và mùa khô hanh. Mùa mưa kéo dài từ tháng 4 đến hết tháng 9, là điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn P. multocida tồn tại và phát triển. Từ năm 2006 - 2008, dựa trên các phương pháp dịch tễ như quan sát triệu chứng, bệnh tích và các số liệu lưu trữ của Chi cục Thú y tỉnh Phú Thọ, chúng tôi tiến hành điều tra số lợn mắc bệnh tụ huyết trùng và chết tại một số địa phương của tỉnh Phú Thọ. Qua điều tra 36.513 lợn từ sơ sinh đến hơn 6 tháng tuổi, chúng tôi đã tiến hành xác định tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết vì bệnh tụ huyết trùng tại 3 địa điểm: Thị xã Phú Thọ, huyện Phù Ninh và Lâm Thao. Kết quả tình hình bệnh tụ huyết trùng lợn tại các địa điểm nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.1.
Qua bảng 3.1 cho thấy, từ năm 2006 đến năm 2008 số lợn mắc bệnh tụ huyết trùng chung trên đàn lợn là 746/36.513 con, chiếm 2,04 % và số lợn chết do bệnh tụ huyết trùng là 54/746 con, chiếm tỷ lệ 7,23 %. Trong đó, địa phương có tỷ lệ lợn mắc tụ huyết trùng cao nhất là xã Sơn Vi huyện Lâm Thao là 8/90 con chiếm 8,88 %.
Tỷ lệ mắc và chết do bệnh tụ huyết trùng giữa các địa phương nghiên cứu có sự khác nhau đã phản ánh được các yếu tố tác động về ngoại cảnh, cũng như tập quán chăn nuôi của người dân trong tỉnh, cụ thể:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.1:Kết quả điều tra bệnh tụ huyết trùng ở lợn tại tỉnh Phú Thọ
Địa điểm Xã Số lợn điều tra (con) Số lợn mắc (con) Tỷ lệ mắc (%) Số lợn chết (con) Tỷ lệ chết (%) H. Lâm Thao Tứ Xã 3.922 84 2,14 6 7,14 Sơn Vi 4.015 90 2,24 8 8,88 Hợp Hải 4.028 80 1,99 7 8,75 H. Phù Ninh Phú Nham 3.928 78 1,99 4 5,12 Gia Thanh 3.903 81 2,08 7 8,64 Hạ Giáp 4.133 83 2,01 6 7,22 T.X Phú Thọ Hà Thạch 4.205 79 1,88 5 6,32 Văn Lung 4.172 86 2,06 4 4,65 Hà Lộc 4.207 85 2,02 7 8,23 Tính chung 36.513 746 2,04 54 7,23
Tại huyện Lâm Thao: Xã Tứ Xã có số lợn mắc bệnh tụ huyết trùng là: Số lợn điều tra là 3922 con, trong đó có 84 con mắc bệnh, chiếm tỷ lệ 2,14 % và số lợn chết do bệnh tụ huyết trùng là 6 con, chiếm tỷ lệ 7,14 %. Xã Sơn Vi có số lợn mắc bệnh tụ huyết trùng là: Số lợn điều tra là 4015 con, trong đó có 90 con mắc bệnh, chiếm tỷ lệ 2,24 % và số lợn chết do bệnh tụ huyết trùng là 8 con, chiếm tỷ lệ 8,88%. Xã Hợp Hải có số lợn mắc bệnh tụ huyết trùng là: Số lợn điều tra là 4028 con, trong đó có 80 con mắc bệnh, chiếm tỷ lệ 1,99 % và số lợn chết do bệnh tụ huyết trùng là 7 con, chiếm tỷ lệ 8,75 %.
Ở huyện Phù Ninh: Xã Phú Nham có số lợn mắc bệnh tụ huyết trùng là: Số lợn điều tra là 3928 con, trong đó có 78 con mắc bệnh, chiếm tỷ lệ 1,99 % và số lợn chết do bệnh tụ huyết trùng là 4 con, chiếm tỷ lệ 5,12%. Xã Gia Thanh có số lợn mắc bệnh tụ huyết trùng là: Số lợn điều tra là 3903 con, trong đó có 81 con mắc bệnh, chiếm tỷ lệ 2,08 % và số lợn chết do bệnh tụ huyết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trùng là 7 con, chiếm tỷ lệ 8,64%. Xã Hạ Giáp có số lợn mắc bệnh tụ huyết trùng là: Số lợn điều tra là 4.133 con, trong đó có 83 con mắc bệnh, chiếm tỷ lệ 2,01 % và số lợn chết do bệnh tụ huyết trùng là 6 con, chiếm tỷ lệ 7,22%.
Thị xã Phú Thọ: Xã Hà Thạch có số lợn mắc bệnh tụ huyết trùng là: Số lợn điều tra là 4205 con, trong đó có 79 con mắc bệnh, chiếm tỷ lệ 1,88 % và số lợn chết do bệnh tụ huyết trùng là 5 con, chiếm tỷ lệ 6,32 %. Xã Văn Lung có số lợn mắc bệnh tụ huyết trùng là: Số lợn điều tra là 4172 con, trong đó có 86 con mắc bệnh, chiếm tỷ lệ 2,06 % và số lợn chết do bệnh tụ huyết trùng là 4 con, chiếm tỷ lệ 4,65 %. Xã Hà Lộc có số lợn mắc bệnh tụ huyết trùng là: Số lợn điều tra là 4207 con, trong đó có 85 con mắc bệnh, chiếm tỷ lệ 2,02 % và số lợn chết do bệnh tụ huyết trùng là 7 con, chiếm tỷ lệ 8,23 %.
Sở dĩ có tỷ lệ lợn chết do bệnh tụ huyết như trên là do ở các địa phương nghiên cứu có vị trí địa lý, khí hậu thời tiết, giao thông hiện nay còn gặp nhiều khó khăn, trình độ dân trí không đồng đều, việc áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật của người dân còn nhiều hạn chế, phương thức chăn nuôi còn nhỏ lẻ, không tập trung, thức ăn không được đáp ứng đầy đủ, điều kiện