3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.4.Kết quả xác định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Pasteurella phân
Các chủng Pasteurella sau khi phân lập, xác định được đặt tên và tiến hành xác định các đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng phân lập được:
3.4.1. Kết quả kiểm tra hình thái, tính chất nhuộm màu
Các chủng vi khuẩn phân lập được tiến hành phiết kính, nhuộm Gram thấy 31/31= 100% chủng vi khuẩn phân lập được bắt màu Gram âm, có dạng cầu trực khuẩn, thường đứng riêng lẻ, đôi khi tạo thành đôi hoặc chuỗi và 31/31= 100% số chủng phân lập được không di động.
3.4.2. Kết quả kiểm tra đặc tính nuôi cấy
Chúng tôi tiến hành kiểm tra đặc tính nuôi cấy của 31 chủng vi khuẩn phân lập được ở các môi trường, kết quả cụ thể như sau:
- Môi trường nước thịt: Sau 24h nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn phát triển làm môi trường vẩn đục, đáy có căn nhày, lắc nhẹ vẩn đục như sương mù. Môi trường có mùi tanh đặc trưng của nước dãi khô.
- Môi trường thạch thường: Sau 24h nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc nhỏ long lanh như hạt sương, để lâu khuẩn lạc to màu trắng đục, nhớt và dính chặt vào mặt thạch.
- Môi trường thạch máu: Sau 24h nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn phát triển mạnh, có hình tròn, kích thước lớn hơn trên thạch thường, có màu tro xám hình giọt sương, không làm dung huyết và đặc biệt có mùi tanh đặc trưng.
- Môi trường Mac Conkey: vi khuẩn không mọc trên môi trường này. Như vậy, các chủng vi khuẩn mà chúng tôi phân lập được đều có những đặc điểm hình thái, tính chất bắt màu phù hợp với đặc tính chung của vi khuẩn P. multocida theo Carter (1984)[54].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.4.3. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa
Sau khi tiến hành kiểm tra các đặc điểm về hình thái, nuôi cấy của các chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tôi tiếp tục tiến hành giám định Pasteurella bằng một số đặc tính sinh hóa học. Kết quả được trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11: Kết quả kiểm tra đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn Pasteurella phân lập được
Các đặc tính Số chủng Pasteurella kiểm tra Kết quả Tỷ lệ (%) Gram (-) 31 31 100 Di động (-) 31 31 100 Idol (+) 31 31 100 Catalaza (+) 31 31 100 Oxydaza (+) 31 31 100 Urease (-) 31 31 100 H2S (-) 31 31 100 Dung huyết (-) 31 31 100 Mọc Mac Conkey (-) 31 31 100
Kết quả kiểm tra đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn Pasteurella phân lập được của chúng tôi tương đồng với kết quả của Carter (1984).
Dùng thuốc thử Kovac để kiểm tra khả năng sinh Idol của vi khuẩn thấy tất cả các chủng đều cho phản ứng dương tính.
+ 100% số chủng phân lập được đều cho phản ứng Oxidaza và Catalaza dương tính.
+ Tất cả các chủng này đều không gây dung huyết thạch máu, không sản sinh H2S và không phân giả urea.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chúng tôi kiểm tra khả năng lên men các loại đường của các chủng
Pasteurella phân lập được. Kết quả thu được ở bảng 3.12.
Bảng 3.12: Kết quả kiểm tra khả năng lên men một số loại đường của các chủng Pasteurella phân lập được
Loại đƣờng Số chủng Pasteurella kiểm tra Kết quả Tỷ lệ (%) Glucose (+) 31 31 100 Mannitol (+) 31 31 100 Maltose (-) 31 31 100 Sorbitol (+) 31 31 100 Galactose (+) 31 31 100 Lactose (-) 31 31 100 Arabinose (-) 31 31 100
Qua bảng 3.12 chúng tôi thấy cả 31 chủng Pasteurella phân lập được (100%) đều lên men đường glucose, galactose, mannitol, sorbitol và không lên men đường lactose, arabinose, maltose.
Căn cứ vào đặc tính sinh vật, hóa học các loài vi khuẩn thuộc giống
Pasteurella mà các tác giả (Hoàng Đạo Phấn 1986[19]),(Heddleston
1972[66]) và (Rimler 1992a [85]) đã mô tả, kết quả của chúng tôi phù hợp với tiêu chuẩn của các tác giả trên.
Kết quả kiểm tra khả năng lên men một số loại đường của 31 chủng
Pasteurella phân lập được cho thấy: 31 chủng đều lên men các loại đường
glucose, galactose, mannitol, sorbitol chiếm tỷ lệ 100% và tất cả đều không lên men lactose, arabinose và maltose, qua đây chúng ta nhận định rằng tất cả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
các chủng vi khuẩn Pasteurella phân lập được ở các địa phương nghiên cứu đều có những đặc tính của vi khuẩn P. multocida và tương đồng với kết quả
của Carter (1984)[54].
3.4.4. Kết quả xác định type P.multocida bằng kỹ thuật PCR
Các chủng vi khuẩn P. multocida chuẩn type A, B dùng làm đối chứng dương do Phân Viện Thú y miền Trung, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y Quốc gia và Viện Thú y Quốc gia Nhật Bản (Tsukuba) cung cấp dùng để so sánh, các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ở lợn nuôi tại 3 huyện Lâm Thao, Phù Ninh, Thị xã Phú Thọ của tỉnh Phú Thọ, mẫu DNA cần xác định được nuôi cấy trực tiếp từ khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Pasteurella đã được nuôi cấy 370C/24 giờ trên môi trường thạch máu.
Ảnh xác định vi khuẩn P. multocida bằng kỹ thuật PCR
Kết quả xác định type như sau:
- Với cặp mồi CAPA-F, CAPA-R, sản phẩm PCR đặc hiệu cho vi khuẩn
P. multocida type A có chiều dài 1044bp đúng như lý thuyết và trùng với các
chủng chuẩn.
- Với cặp mồi CAPB-F, CAPB-R, sản phẩm PCR đặc hiệu cho vi khuẩn
P. multocida type B có chiều dài 760bp trùng với các chủng chuẩn.
Qua kết quả trên chúng tôi có nhận xét bằng kỹ thuật PCR đã xác định được các chủng P. multocida phân lập từ lợn ở huyện Lâm Thao, huyện Phù Ninh và Thị xã Phú Thọ có hình ảnh đặc trưng của các type A, B chuẩn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.13. Kết quả định type vi khuẩn P. multocida bằng phản ứng PCR
Nguồn gốc phân lập
Số chủng thử
Kết quả định type kháng nguyên giáp mô Type A Tỷ lệ (%) Type B Tỷ lệ (%)
Dịch ngoáy mũi lợn khỏe 19 5 26,32 14 73,68 Bệnh phẩm lợn ốm chết có
triệu chứng bệnh THT 12 4 33,33 8 66,67
Tính chung 31 9 29,03 22 70,97
Bảng 3.13 cho thấy với tổng số 31 chủng thì có 9 chủng thuộc type A, nguồn gốc phân lập từ dịch ngoáy mũi lợn khỏe và bệnh phẩm lợn ốm chết có triệu chứng nghi mắc bệnh THT và chiếm tỷ lệ 29,03%, có 22 chủng thuộc type B, nguồn gốc phân lập từ dịch ngoáy mũi lợn khỏe và bệnh phẩm lợn ốm chết có triệu chứng nghi mắc bệnh THT và chiếm tỷ lệ 70,97%. Trong mỗi loại bệnh phẩm tỷ lệ phân lập được các type vi khuẩn cũng khác nhau, cụ thể: 19 chủng P.
multocida phân lập được từ dịch ngoáy mũi lợn khỏe có 5 chủng thuộc type A
chiếm tỷ lệ 26,32%, có 14 chủng thuộc type B chiếm tỷ lệ 73,68%. Đối với 12 chủng phân lập từ bệnh phẩm lợn ốm thấy có 4 chủng thuộc type A, 8 chủng thuộc type B, chiếm tỷ lệ 33,33%, 66,67%. Kết quả định type của chúng tôi có khác so với kết quả định type của Cù Hữu Phú và cs (2005)[21] khi định type các chủng P.multocida bằng phương pháp Co-agglutination (đồng ngưng kết)
với kháng huyết thanh đặc hiệu cho kết quả 100% là type D. Nhưng kết quả của chúng tôi cũng tương đương với kết quả của Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2007)[8] bằng kỹ thuật PCR cho biết các chủng P. multocida định type thuộc các type A,B,D trong đó nhiều nhất phải kể đến là type B (các chủng
P.multocida này phân lập được từ cả lợn ốm và lợn khỏe). Kết quả của Đỗ Ngọc
Thúy và cs (2007)[36]cho thấy các chủng P. multocida phân lập được ở dịch ngoáy mũi lợn khỏe và bệnh phẩm lợn ốm khi định type bằng kỹ thuật PCR chủ yếu là type A, chỉ có 1 chủng thuộc type D.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.4.5. Kết quả xác định độc lực của các chủng P. multocida phân lập được
Đặc tính của vi khuẩn P. multocida là khi cấy chuyển nhiều đời trên
môi trường nhân tạo thường bị giảm độc lực theo thời gian bảo quản (Carter, 1967)[52]. Vì vậy để đánh giá độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida
phân lập được chúng tôi tiến hành kiểm tra độc lực của 15 chủng này trên chuột bạch. Kết quả được trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14: Kết quả xác định độc lực của các chủng P. multocida phân lập được Chủng vi khuẩn kiểm tra Nguồn gốc mẫu Type Số chuột tiêm (con) Liều tiêm Đƣờng tiêm
Kết quả kiểm tra Số chuột chết (con) Tỷ lệ chết (%) Thời gian giết chết chuột (giờ) LT1 Bệnh phẩm B 2 0.2ml Phúc xoang 2/2 100 20-22 LT5 Bệnh phẩm A 2 0.2ml 2/2 100 24-35 LT12 Dịch mũi A 2 0.2ml 1/2 50 24-36 LT14 Bệnh phẩm B 2 0.2ml 2/2 100 20-24 LT20 Bệnh phẩm B 2 0.2ml 2/2 100 20 PN4 Dịch mũi A 2 0.2ml 1/2 50 25-35 PN7 Bệnh phẩm B 2 0.2ml 2/2 100 20-24 PN5 Bệnh phẩm B 2 0.2ml 2/2 100 20 PN9 Dịch mũi A 2 0.2ml 1/2 50 25-35 PN10 Bệnh phẩm B 2 0.2ml 2/2 100 25-30 TX10 Dịch mũi A 2 0.2ml 2/2 100 20-24 TX15 Bệnh phẩm B 2 0.2ml 2/2 100 20 TX30 Bệnh phẩm B 2 0.2ml 2/2 100 20-24 TX29 Bệnh phẩm B 2 0.2ml 2/2 100 20 TX31 Dịch mũi A 2 0.2ml 1/2 50 25-48
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Ở bảng 3.14 cho thấy có 15/15 chủng P. multocida phân lập được chiếm 100% có độc lực giết chết chuột trong vòng 20-48 giờ. Các chuột sau khi tiêm thấy ủ rũ, kém vận động, lông xù, run rẩy và chết.
Trong 15 chủng vi khuẩn P. multocida có 11 chủng, chiếm tỷ lệ 73,33% có độc lực cao giết chết 2/2 chuột trong vòng 20-35giờ. Còn lại 4 chủng khác, chiếm 26,67% có độc lực thấp hơn chỉ giết chết 1/2 chuột với thời gian chết sau khi tiêm 23-48 giờ. Từ kết quả trên cho thấy độc lực của các chủng vi khuẩn gây bệnh THT lợn ở các địa phương nghiên cứu cao. Tuy nhiên nếu so sánh kết quả thử độc lực của chúng tôi với kết quả của Võ Văn Hùng (1997)[10] tiến hành với các chủng phân lập được từ dịch ngoáy mũi lợn khỏe ở Đắk Lắk thấy cả 17 chủng đem thử đều có độc lực giết chết 100% chuột trong vòng 4-5 giờ. Chứng tỏ các chủng phân lập được ở Đắk Lắk có độc lực cao hơn.
Từ kết quả số liệu ở bảng 3.14 cho thấy các chủng P. multocida gây bệnh THT lợn phân lập được ở huyện Lâm Thao, huyện Phù Ninh và Thị xã Phú Thọ có độc lực mạnh, giết chết chuột trong vòng 20-24giờ. Các chủng phân lập từ lợn khỏe có độc lực giết chết chuột yếu hơn (giết chết 1/2 hay không giết chết chuột) so với các chủng phân lập từ bệnh phẩm.
Kết quả trên cũng cho thấy lợn khỏe mang trùng là nguồn thải mầm bệnh ra ngoài môi trường. Trong các ổ dịch THT lợn ở huyện Lâm Thao, huyện Phù Ninh và Thị xã Phú Thọ có vai trò của các chủng vi khuẩn
P.multocida độc lực yếu hoặc không có độc lực ở đường hô hấp trên của lợn
khỏe, chúng tăng độc lực và gây bệnh khi sức đề kháng của gia súc giảm sút. Đây cũng chính là nguồn bệnh tiềm tàng cần được lưu ý trong công tác phòng chống dịch bệnh THT lợn và các loài gia súc khác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.4.6. Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh của các chủng P. multocida phân lập được
Người chăn nuôi ở các tỉnh nói chung và ở Phú Thọ nói riêng thường sử dụng thuốc phòng và trị bệnh cho vật nuôi không theo chỉ dẫn hoặc sử dụng không đúng liều quy định, việc trộn kháng sinh vào thức ăn để phòng bệnh không chỉ ở vi khuẩn P. multocida mà còn với các loại vi khuẩn khác, điều này có thể nảy sinh những mối nguy hiểm cho người tiêu dùng. Do vậy, trong điều trị bệnh tụ huyết trùng ở lợn cần có quy trình điều trị đúng thuốc, đúng phác đồ và liệu trình điều trị thì sẽ hạn chế thiệt hại cho người chăn nuôi và ảnh hưởng tới sức khỏe của cộng đồng.
Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại kháng sinh được sử dụng điều trị bệnh tụ huyết trùng lợn, để điều trị bệnh THT hiệu quả cao chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được và đánh giá khả năng mẫn cảm theo 3 mức độ: Rất mẫn cảm, mẫn cảm và không mẫn cảm, từ đó có thể khuyến cáo người chăn nuôi chọn những loại kháng sinh điều trị bệnh có hiệu quả cao. Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ được trình bày ở bảng 3.15.
Bảng 3.15: Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng P. multocida phân lập được
Loại kháng sinh Số mẫu kiểm tra Kết quả Rất mẫn cảm Mẫn cảm Kháng Số mẫu Tỷ lệ (%) Số mẫu Tỷ lệ (%) Số mẫu Tỷ lệ (%) Lincospectinomycin 11 7 63,64 4 36,36 0 0 Neomycin 11 5 45,45 6 54,55 0 0 Kanatialin 11 8 72,73 3 27,27 0 0 Gentamycin 11 5 45,45 4 36,36 2 18,18 Streptomycin 11 4 36,36 2 18,18 5 45,45
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Qua bảng 3.15 cho thấy: Ở các chủng vi khuẩn phân lập được ở các địa phương nghiên cứu đều rất mẫn cảm với các loại kháng sinh thử, có tỷ lệ cao nhất là 72,73% (Kanatialin) và thấp nhất là 36,36% (Streptomycin).
Ở mức độ mẫn cảm: Tất cả các chủng đều mẫn cảm với các loại kháng sinh đem thử, có tỷ lệ cao nhất là 54,55%(Neomycin) và thấp nhất là 18,18% (Streptomycin). Ở mức độ kháng kháng sinh: Có 2 loại không mẫn cảm đó là 18,18% (Gentamycin) và Streptomycin tỷ lệ 45,45%.
Với kết quả trên để điều trị bệnh tụ huyết trùng lợn ở các địa phương trong tỉnh Phú Thọ cho hiệu quả cao chúng tôi khuyến cáo nên chọn các loại kháng sinh rất mẫn cảm là Kanatialin, Lincospectinomycin để điều trị bệnh tụ huyết trùng cho lợn.