2.2.1. Chuẩn bị phụ gia
Tiến hành pha dung dịch NaHCO3: Hòa tan 1,14 g NaHCO3 trong 1,0 lít nƣớc cất, đƣợc dung dịch NaHCO3 0,114%.
2. 2. 2. Lấy mẫu và sơ chế mẫu
Tiến hành khảo sát trên xƣơng ống của con bò ở hai vị trí khác nhau là thân xƣơng và đầu xƣơng. Xƣơng bò tự nhiên chƣa qua xử lí, loại bỏ phần thịt, mỡ và lớp màng bám bên ngoài xƣơng, sau đó cƣa và cắt xƣơng thành những khối nhỏ có kích thƣớc khoảng 4 x 6 x 6 mm.
Xƣơng sau khi đƣợc cắt, đem rửa bằng etanol và nƣớc cất để làm sạch, loại bỏ các tạp chất cơ học và các hợp chất hữu cơ, rồi tiến hành ninh mẫu ở các điều kiện nhiệt độ, áp suất và với phụ gia NaHCO3.
2. 3. Phƣơng pháp tiến hành
Việc tách HA từ phần thân xƣơng và đầu xƣơng của xƣơng bò tự nhiên đƣợc tiến hành bằng phƣơng pháp ninh, dƣới ảnh hƣởng của các yếu tố nhƣ nhiệt độ, áp suất và chất phụ gia.
Phƣơng pháp 1: Ninh mẫu xƣơng ở điều kiện áp suất thƣờng, không có phụ gia. Phƣơng pháp 2: Ninh mẫu xƣơng ở điều kiện áp suất thƣờng, có phụ gia.
Phƣơng pháp 3: Ninh mẫu xƣơng ở điều kiện trong nồi áp suất, không có phụ gia.
2. 3. 1. Tạo mẫu HA nguyên bản
Lấy 10,0 g mẫu xƣơng (đã thực hiện ở mục 2.2.2) giữ nguyên hình dạng và sấy
khô ở điều kiện nhiệt độ 90- 110oC, nghiền nhỏ và mịn rồi tiếp tục sấy trong thời gian 60 giờ. Lấy ½ lƣợng mẫu đem nung ở 7000C trong 2 giờ, màu sắc của mẫu xƣơng trƣớc và sau khi nung không thay đổi.
Bảng 2.1: Tên và kí hiệu các mẫu HA nguyên bản
STT Kí hiệu mẫu Tên mẫu
1 NB1 Mẫu HA đƣợc lấy từ hai đầu của xƣơng ống, giữ nguyên thành phần của xƣơng, không xử lý nhiệt
2 NB2 Mẫu HA đƣợc lấy từ thân xƣơng, đƣợc giữ nguyên thành phần, không xử lý nhiệt
3 NB3 Mẫu NB1, sau đó đem nung ở 7000C trong 2 giờ
4 NB4 Mẫu NB2, sau đó đem nung ở 7000C trong 2 giờ
2. 3. 2. Ninh mẫu xƣơng ở điều kiện áp suất thƣờng, không có phụ gia
Cho 20 g mẫu xƣơng (đã thực hiện ở mục 2.2.2) và 300 ml nƣớc cất vào cốc thủy tinh chịu nhiệt có thể tích là 500 ml, để trên khay cát ở trên bếp điện rồi tiến hành ninh. Việc sử dụng khay cát với mục đích là để giữ và truyền nhiệt ổn định cho cốc chứa mẫu xƣơng ninh. Trong quá trình ninh mẫu, thƣờng xuyên kiểm tra nhiệt độ trong cốc ninh mẫu dao động trong khoảng từ 100 – 1020C, trên bề mặt dung dịch của cốc mẫu ninh xuất hiện lớp váng màu trắng nổi lên. Khi trong cốc mẫu xƣơng ninh chỉ còn khoảng 50 -70 ml dung dịch thì thay dung dịch đó đi, nhằm loại bỏ một số
hợp chất hữu cơ ở bên trong mẫu xƣơng đã đƣợc tách ra. Tiếp tục rửa sạch mẫu bằng nƣớc cất và thay nƣớc cất vào cốc mẫu rồi đem ninh, đồng thời thƣờng xuyên theo dõi thời gian ninh mẫu, màu sắc của các mẫu xƣơng trƣớc và sau khi ninh thay đổi không nhiều. Mỗi loại xƣơng đƣợc chia thành 3 phần khác nhau để thu đƣợc 3 kết quả khác nhau.
- Phần 1: Mẫu xƣơng đƣợc ninh trong cốc thủy tinh ở điều kiện áp suất thƣờng, không có phụ gia, thời gian ninh gần bằng ½ thời gian của mẫu ninh tới nhừ.
- Phần 2: Mẫu xƣơng đƣợc ninh ở điều kiện áp suất thƣờng, không có phụ gia và ninh mẫu tới nhừ.
- Phần 3: Lấy ½ mẫu xƣơng ở phần 2 đã đƣợc ninh tới nhừ sau đó sấy khô ở 90 - 1100C rồi đem nung ở 7000C trong 2 giờ.
Bảng 2.2: Tên mẫu, kí hiệu các mẫu HA và thời gian khảo sát ở điều kiện áp
suất thường, không có phụ gia
STT Kí hiệu
mẫu Tên mẫu
Thời gian khảo sát
1 T1 Mẫu trung gian của mẫu T2 30 giờ
2 T2 Mẫu lấy ở hai đầu xƣơng, ninh đến nhừ 58 giờ
3 T3 Mẫu T2, đem nung ở 7000C trong 2 giờ 58 giờ
4 T4 Mẫu trung gian của mẫu T5 100 giờ
5 T5 Mẫu lấy ở thân xƣơng, ninh đến nhừ 196 giờ
6 T6 Mẫu T5, đem nung ở 7000C trong 2 giờ 196 giờ
2. 3. 3. Ninh mẫu xƣơng ở điều kiện áp suất thƣờng, có phụ gia.
Cho 20 gam mẫu xƣơng (đã thực hiện ở mục 2.2.2) và 300 ml dung dịch NaHCO3 0,114% vào cốc thủy tinh chịu nhiệt có thể tích 500 ml rồi tiến hành ninh mẫu. Trong quá trình ninh mẫu xƣơng, nhiệt độ sôi của cốc xƣơng ninh là từ 100 – 1040C, trên bề mặt dung dịch của cốc mẫu ninh xuất hiện lớp váng màu trắng nổi lên. Khi dung dịch trong cốc xƣơng ninh giảm đi 80 – 100 ml thì thay dung dịch NaHCO3 trong cốc xƣơng và rửa sạch mẫu xƣơng bằng nƣớc cất, rồi cho thêm lƣợng dung dịch NaHCO3 tƣơng ứng vào. Mục đích là duy trì nồng độ dung dịch NaHCO3 ở trong cốc mẫu ninh thay đổi không đáng kể, đồng thời thƣờng xuyên theo dõi thời gian ninh mẫu. Màu sắc của mẫu xƣơng trƣớc khi ninh có màu trắng ngà đã chuyển sang màu
trắng sáng sau khi ninh. Mỗi loại xƣơng lại đƣợc chia thành 3 phần khác nhau để thu đƣợc 3 kết quả khác nhau.
- Phần 1: Mẫu xƣơng đƣợc ninh ở điều kiện áp suất thƣờng, trong dung dịch NaHCO3, thời gian ninh gần bằng ½ thời gian của mẫu ninh tới nhừ.
- Phần 2: Mẫu xƣơng đƣợc ninh ở điều kiện áp suất thƣờng, có phụ gia và ninh mẫu tới nhừ.
- Phần 3: Lấy ½ mẫu xƣơng ở phần 2 đã đƣợc ninh tới nhừ sau đó sấy khô ở 90 – 1100C rồi đem nung ở 7000C trong 2 giờ.
Bảng 2.3: Tên mẫu, kí hiệu mẫu và thời gian khảo sát ở điều kiện áp suất
thường, có phụ gia
STT Kí hiệu
mẫu Tên mẫu
Thời gian khảo sát
1 P1 Mẫu trung gian của mẫu P2 10 giờ
2 P2 Mẫu lấy ở hai đầu xƣơng, ninh đến nhừ 16 giờ
3 P3 Mẫu P2, đem nung ở 7000C trong 2 giờ 16 giờ
4 P4 Mẫu trung gian của mẫu P5 50 giờ
5 P5 Mẫu lấy ở thân xƣơng, ninh đến nhừ 90 giờ
6 P6 Mẫu P5, đem nung ở 7000C trong 2 giờ 90 giờ
2. 3. 4. Ninh ở điều kiện trong nồi áp suất, không có phụ gia.
Cho 20 g mẫu xƣơng (đã thực hiện ở mục 2.2.2) và 300 ml nƣớc cất vào cốc thủy tinh chịu nhiệt có thể tích 500 ml, tiếp tục cho 800 ml nƣớc cất vào nồi áp suất, rồi cho cốc chứa mẫu xƣơng ninh vào nồi áp suất, rồi tiến hành ninh mẫu, nhiệt độ ninh mẫu trong nồi áp suất tối đa là 1200C, áp suất 1,7 atm. Trong quá trình ninh mẫu xƣơng thƣờng xuyên thay nƣớc trong cốc mẫu và trong nồi áp suất, đồng thời theo dõi thời gian ninh, màu sắc của mẫu xƣơng trƣớc và sau khi ninh không thay đổi. Mỗi loại xƣơng đƣợc chia thành 3 phần khác nhau để thu đƣợc 3 kết quả khác nhau. - Phần 1: Mẫu xƣơng đƣợc ninh ở điểu kiện trong nồi áp suất, không có phụ gia, thời gian ninh gần bằng ½ thời gian của mẫu ninh tới nhừ.
- Phần 2: Mẫu xƣơng đƣợc ninh ở điểu kiện trong nồi áp suất, không có phụ gia, ninh tới nhừ.
- Phần 3: Lấy ½ mẫu xƣơng ở phần 2 đã đƣợc ninh tới nhừ sau đó sấy khô rồi đem nung ở 7000
Bảng 2.4: Tên mẫu, kí hiệu mẫu và thời gian khảo sát ở điều kiện trong nồi áp
suất thường, không có phụ gia
STT Kí hiệu
mẫu Tên mẫu
Thời gian khảo sát
1 A1 Mẫu trung gian của mẫu A2 5 giờ
2 A2 Mẫu lấy ở hai đầu xƣơng, ninh đến nhừ 12 giờ
3 A3 Mẫu A2, đem nung ở 7000C trong 2 giờ 12 giờ
4 A4 Mẫu trung gian của mẫu A5 30 giờ
5 A5 Mẫu lấy ở thân xƣơng, ninh đến nhừ 52 giờ
6 A6 Mẫu A5, đem nung ở 7000C trong 2 giờ 52 giờ
2. 4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình tách HA
2. 4. 1. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình tách HA, ở điều kiện áp suất thƣờng, không có phụ gia
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành ở nhiệt độ từ 100 - 1020C. Quan sát, theo dõi thời gian ninh của các mẫu. Sản phẩm HA đƣợc đánh giá bằng các phƣơng pháp XRD, FTIR, SEM, phân tích nhiệt và độ xốp tổng.
2. 4. 2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình tách HA, ở điều kiện áp suất thƣờng, có chất phụ gia
Các mẫu xƣơng đƣợc ninh trong dung dịch NaHCO3 0,114%. Với thời gian khảo sát khác nhau. Chất lƣợng HA đƣợc đánh giá bằng XRD, FTIR và độ xốp tổng.
2. 4. 3. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình tách HA, ở điều kiện trong nồi áp suất, không có phụ gia nồi áp suất, không có phụ gia
Các mẫu xƣơng đƣợc ninh trong nồi áp suất, ở nhiệt độ tối đa là 1200C và áp suất là 1,7 atm, đƣợc khảo sát ở các thời gian khác nhau. Sử dụng các phƣơng pháp XRD, FTIR, SEM, phân tích thành phần hóa học và độ xốp tổng để đánh giá sản phẩm.
2. 5. Chuẩn bị mẫu phân tích
Trƣớc khi phân tích, sấy mẫu HA ở 900C, nghiền nhỏ, sấy tiếp ở 1100C trong 48 giờ, sau đó nghiền mịn. Các mẫu đƣợc đo bằng các phƣơng pháp sau:
2.5.1. Nhiễu xạ tia X (XRD)
Các mẫu đƣợc đo XRD trên máy SIEMENS D5005 Bruker (Đức), tại Viện Khoa học Vật liệu (Viện KH&CN Việt Nam), ở các điều kiện nhƣ sau: bức xạ Cu - Kα có bƣớc sóng là 1,5406 A0, điện áp 40 kV, góc quét 2 trong khoảng 10 70, tốc độ quét 0,0300/giây.
2.5.2. Phổ hồng ngoại (FTIR)
Phổ FTIR của các mẫu đƣợc ghi trên máy IMPAC 410 – Nicolet (Mỹ), tại Viện Hoá học (Viện KH&CN Việt Nam). Các mẫu đƣợc nén ép thành viên với KBr theo tỷ lệ (1: 400), đƣợc đo trong khoảng từ 500 đến 4000 cm-1.
2.5.3. Hiển vi điện tử quét (SEM)
Ảnh SEM của các mẫu đƣợc đo trên thiết bị hiển vi điện tử quét Hitachi S4800 (Nhật Bản), tại Viện Khoa học Vật liệu (Viện KH&CN Việt Nam). Trƣớc khi đo, các mẫu đƣợc phủ Pt trong chân không để tăng độ nét của ảnh SEM do HA có độ dẫn điện kém.
2.5.4. Phân tích nhiệt
Kết quả của các mẫu đƣợc đo trên thiết bị phân tích nhiệt DTG – 60H (Nhật Bản), tại Phòng phân tích nhiệt (Đại học Sƣ phạm Hà Nội).
2.5.5. Phân tích thành phần hóa học
Kết quả của các mẫu đƣợc phân tích trên máy ASS – (Perkin Elner-3300) tại Viện Hoá học (Viện KH&CN Việt Nam).
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả các mẫu HA nguyên bản
Kết quả phân tích các mẫu HA của xƣơng nguyên bản, với mục đích là để đánh giá và so sánh với các sản phẩm HA tách từ xƣơng trong các điều kiện khác nhau.
Các mẫu HA nguyên bản được khảo sát bằng phương pháp XRD, FTIR, SEM, phân tích nhiệt, thành phần hóa học và độ xốp tổng .
3.1.1. Giản đồ XRD
Giản đồ XRD của các mẫu HA nguyên bản NB1, NB2, NB3, NB4 đƣợc chỉ ra ở hình 3.1.
Hình 3.1:Giản đồ XRD của các mẫu HA nguyên bản NB1, NB2, NB3 và NB4
Trên giản đồ XRD của hai mẫu NB1và NB2, chỉ xuất hiện các vạch nhiễu xạ đặc trƣng của HA. Vạch có cƣờng độ lớn nhất xuất hiện tại vị trí 2 = 31,770
của mặt phẳng (211) và các vạch có cƣờng độ tƣơng đối yếu ở các vị trí 25,88; 46,68; 39,79; 49,450, nhƣng các vạch đặc trƣng chồng chập tạo thành một vạch rộng và có cƣờng độ yếu, chứng tỏ HA thu đƣợc có độ tinh thể rất thấp. Do các vạch nhiễu xạ đặc trƣng dùng để tính độ tinh thể (ở vị trí 2 là 32,19 và 32,900
) không tách biệt nhau, thậm chí là không xác định đƣợc độ tinh thể của mẫu HA ở giản đồ NB1 và NB2.
Trên giản đồ XRD của NB3 và NB4, đƣợc nung ở 7000C trong 2 giờ, xuất hiện đầy đủ các vạch nhiễu xạ đặc trƣng của HA ( so với JCPDS#24 - 0033). Trên giản đồ
(NB1) (NB2)
của NB3 tồn tại vạch yếu đặc trƣng cho Ca3(PO4)2 (JCPDS#9-0169). Ở giản đồ của NB4 không thấy sự có mặt của các pha lạ, các vạch nhiễu xạ trở nên nhọn, rõ ràng và tách biệt khỏi nhau. Các vạch nhiễu xạ đó gồm vạch có cƣờng độ mạnh nhất ở 2 = 31,770 của mặt phẳng (211), hai vạch có cƣờng độ gần bằng nhau ở 32,19 và 32,900 tƣơng ứng với các mặt phẳng (112) và (300). Ngoài ra, còn các vạch có cƣờng độ tƣơng đối mạnh ở các vị trí 25,88; 30,04; 39,79; 46,68; 49,450
[14].
So với giản đồ NB1 và NB2 có thể thấy trên giản đồ của NB3 và NB4, các vạch nhiễu xạ đặc trƣng tách biệt khỏi nhau có cƣờng độ tăng lên và rõ ràng hơn, đồng thời độ rộng của chúng giảm. Điều đó cho thấy độ tinh thể của giản đồ NB3 và NB4 cao hơn của NB1 và NB2 rất nhiều. Do xƣơng đƣợc nung trong 2 giờ, các chất hữu cơ (collagen, tủy xƣơng, dịch sinh học …) cháy hết. Đồng thời nhiệt độ cao làm tăng độ tinh thể của xƣơng.
3.1.2. Phổ FTIR
Phổ FTIR của các mẫu HA nguyên bản đƣợc chỉ ra ở hình 3.2.
Hình 3.2: Phổ FTIR của các mẫu HA nguyên bảnNB1, NB2, NB3, NB4
(NB3)
(NB2) (NB1)
Phổ FTIR của các mẫu ép viên theo tỉ lệ 1mg HA với 400 mg KBr đo trên máy IMPACT 410 – Nicolet trong vùng 4000 – 500 cm-1 đƣợc chỉ ra ở hình 3.2.
Trên phổ FTIR của mẫu NB1, không xuất hiện các dải phổ đặc trƣng của HA, do trong mẫu HA của NB1 là mẫu nguyên bản có các hợp chất hữu cơ nhƣ máu, cơ, gân, có thành phần là protein và chất béo còn nhiều nên không thu đƣợc phổ đặc trƣng của HA nguyên bản nhƣ giản đồ XRD. Điều này cũng phù hợp với thực tế là ở hai đầu xƣơng có cấu trúc xốp, chứa rất nhiều các chất hữu cơ.
Mẫu NB2: Phổ FTIR trở nên rõ nét hơn, xuất hiện các dải phổ ở vị trí từ 1042 đến 900, 602, 569 và 478 cm-1 đặc trƣng cho các dao động của nhóm 3
4
PO . Không xuất hiện các dải phổ của nhóm OH, trên phổ xuất hiện các vân hấp thụ với cƣờng độ mạnh trong vùng từ 1660 đến 1410 cm-1 đặc trƣng cho nhóm 2
3
CO , cũng xuất hiện dải phổ hấp thụ ở vị trí 875 cm-1 đặc trƣng cho nhóm 2
4
HPO , dải phổ 3420 cm-1 là của các phân tử H2O liên kết hydro. Ngoài ra, trên phổ còn có các dải hấp thụ ở vùng 2956 cm-
1
với cƣờng độ yếu, đặc trƣng cho nhóm – CH2 – của một lƣợng rất nhỏ các tạp chất hữu cơ có thể vẫn tồn tại trong mẫu.
Đối với mẫu NB3 và NB4 trên hình 3.2 cho thấy, đều xuất hiện các dải phổ đặc trƣng cho cấu trúc phân tử HA (Ca10(PO4)6(OH)2. Các dải phổ ở các vị trí 635 cm-1 và 3571 cm-1 đặc trƣng cho các dao động của nhóm OH trong cấu trúc. Các dải phổ ở vị trí từ 1040 đến 1049 cm-1, 966, 603, 568 và 478 cm-1 đặc trƣng cho các dao động của nhóm 3
4
PO . Sản phẩm HA của mẫu NB3 và NB4 đƣợc đánh giá là tốt khi có các dải phổ đặc trƣng ở vị trí 635 cm-1, 568 – 603 cm-1 xuất hiện rõ nét.
3.1.3. Ảnh SEM
Dựa vào kết quả ảnh SEM, có thể xác định hình dạng và kích thƣớc tƣơng đối của các hạt HA.
Hình 3.3: Ảnh SEM của các mẫu HA nguyên bản NB1(NB1a, NB1b, NB1c) và NB2 (NB2.a, NB2.b, NB2.c)
Quan sát ảnh SEM NB1.a, NB1.b và NB1.c trên hình 3.3 nhận thấy, các hạt chƣa hình thành rõ rệt, chƣa xác định đƣợc hình dạng, kích thƣớc cụ thể của hạt HA. Do đây là mẫu HA nguyên bản, đƣợc lấy từ hai đầu xƣơng có cấu trúc xốp, hàm lƣợng các hợp chất hữu cơ trong mẫu cao, nên các hạt HA bị bao phủ và phân bố trong môi trƣờng của các hợp chất hữu cơ. Vì vậy, hình dạng các hạt HA chƣa xuất hiện rõ ràng.
NB1.c
NB1.a NB1.b
NB2.a
Trên ảnh của các mẫu NB2.a, NB2.b và NB2.c các hạt HA kết tập với nhau thành từng khối không có hình dạng rõ ràng. Các mẫu HA của NB2 có cấu trúc đặc khít nên