Công ựoạn làm giàu hỗn hợp axắt béo không thay thế omega-3 và omega-6 nhằm tạo sản phẩm có ựộ tinh khiết cao ựược thực hiện chủ yếu bằng các phương pháp: Phương pháp kết tinh phân ựoạn ở nhiệt ựộ thấp: dựa vào sự khác biệt về ựiểm ựông ựặc (kết tinh) của các axắt béo khi hoà tan trong dung môi phù hợp. Phương pháp này thắch hợp cho việc tách các axắt béo no ra khỏi hỗn hợp axắt béo không nọ Tuy nhiên, phương pháp kết tinh phân ựoạn ở nhiệt ựộ thấp không tách ựược triệt ựể các axắt béo no cũng như không thể tách ựược axắt béo không no một nối ựôi (như axắt béo oleic) ra khỏi hỗn hợp axắt béo omega-3 và omega-6. Do vậy, hỗn hợp axắt béo omega- 3 và omega-6 thu ựược từ phương pháp này có ựộ tinh sạch không cao (thường chỉ ựạt 60 - 70%).
Phương pháp tạo phức với urê: ựược dựa trên khả năng ựặc biệt của urê khi tạo phức kết tinh với các axắt béo no và axắt béo không no một nối ựôi (ựiều này không xảy ra ựối với các axắt béo không no ựa nối ựôi). Việc phát hiện ra khả năng tạo phức kết tinh của urê với các hợp chất hydrocacbon mạnh thẳng trong dung môi ethanol hoặc methanol ựược thực hiện bởi Bengen F. và các cộng sự vào năm 1940. Phát hiện này ựược xem như là cuộc cách mạng trong công nghiệp hóa học dầu và mỡ. Kỹ thuật này rất hiệu quả trong việc làm tinh sạch các axắt béo không no ựa nối ựôi từ dầu và mỡ. Trong suốt thời gian nghiên cứu về sữa tác giả ựã chỉ ra rằng urê cùng với cồn hoặc methanol tạo tinh thể với các hợp chất mạch thẳng nhưng không tạo tinh thể với các hợp chất có mạch nhánh hoặc mạch vòng. Sau ựó ông ựã khái quát hóa hiện tượng này tới các hydrocacbon, các axắt béo, các este, các rượu, các aldehit và keton. Một số các nghiên cứu của nhóm Bengen ựã ựược ứng dụng tại các công ty hóa dầu nhằm phân tách các hydratcacbon mạch thẳng và mạch vòng [18].
Theo Shucheng và các cộng sự [15], ựây là phương pháp tách các axắt béo no và axắt béo không no một nối ựôi ra khỏi axắt béo không no ựa nối ựôi dựa trên nguyên lý axắt béo no và axắt béo không no một nối ựôi sẽ tạo thành phức kết tủa với urê. Trong khi ựó, các axắt béo không no ựa nối ựôi thì không tạo phức kết tủa với urê. để thực hiện phản ứng tạo phức triệt ựể giữa urê với axắt béo no, axắt béo không no một nối ựôi thường sử dụng một trong các dung môi hữu cơ ựể hòa tan cả urê và axắt béo như methanol, cồn
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28 hoặc 2-propanol vì khi ựó có sự hiện diện methyl este hóa của axắt béo hình thành tinh thể lục giác có lỗ rỗng ở giữa, với lỗ rỗng này một vài axắt béo không no một nối ựôi có thể lọt vừa khắt. Trong quá trình thực hiện phản ứng sẽ hình thành phức và kết tủa xuống trong khi các axắt béo không no ựa nối ựôi sẽ ở lại trong dịch, từ dịch chiết chúng ta sẽ thu ựược hỗn hợp axắt béo omega-3 và omega-6 có ựộ tinh khiết cao hơn nhiều so với hỗn hợp ban ựầu bằng cách cất thu hồi dung môị Do tắnh chất hóa học của urê tan tốt trong nước nên trong quá trình làm giàu dễ dàng loại ựược urê ra khỏi hỗn hợp axắt béo omega-3 và omega-6 bằng phương pháp rửạ Tiếp ựó hỗn hợp axắt béo omega-3 và omega-6 ựược làm khô bằng muối khan.
Kỹ thuật tạo phức với urê ựã ựược phát triển và trở thành công cụ hữu hiệu trong việc làm tinh sạch các axắt béo không no ựa nối ựôi (omega-3 và omega-6) từ nguồn nguyên liệu dầu thực vật. Với phương pháp này, có thể tinh sạch hỗn hợp axắt béo omega-3 và omega-6 ựạt từ 80-95%.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
Phần III
đỐI TƯỢNG Ờ NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
3.1.1. Nguyên liệu:
Hạt cải dầu thu ựược từ 4 giống cải dầu trồng ở Hà Giang vụ đông Xuân 2010- 2011: TP1 HL-1, TP2 H-B1, TP3 Hpro, TP4 HA1 nhập khẩu từ Úc.
3.1.2. Hóa chất
- Urê tinh thể (ựộ tinh khiết > 99%) - Na2SO4
- Cồn 96% - H2SO4 - NaOH - HCl - CH3OH - CH3COOH - K3Fe(CN)6 - KI - ZnSO4 - Phenolphtalein - Na2S2O3 - Chloroform - K2SO4 - CuSO4
- Methyl da cam - P-dimethylaminobenzaldehyt
- Hồ tinh bột - Benzen
- Axắt Axetic - Axắt boric
- KOH - n-hexan
- Nước cất - Một số dung môi hữu cơ khác
3.1.3. Dụng cụ, thiết bị
- Bếp ựiện, bếp cách thuỷ
- Bình cầu các loại gắn với sinh hàn hồi lưu
- Phễu chiết, phễu lọc, cốc ựong, ống ựong và bình tam giác các loại - Pipet các loại, giấy lọc, nhiệt kế các loại
- Buret các loại
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30 - Bình ựựng mẫu
- Thiết bị cô quay chân không Buchi
- Thiết bị xác ựịnh hàm lượng dầu của hãng Velp, Italia - Thiết bị khuấy từ có gia nhiệt và ựiều khiển tự ựộng - Thiết bị làm lạnh
- Tủ hút Kottermann - Germany
- Tủ sấy tự ựộng khống chế nhiệt ựộ Memmerr Model 500 D06061 - Cân phân tắch, cân kỹ thuật
- Một số thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh khác.
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1. Phương pháp phân tắch 3.2.1. Phương pháp phân tắch
3.2.1.1. Xác ựịnh ựộ ẩm dầu hạt cải bằng phương pháp sấy ựến khối lượng không ựổi [4].
Cách tiến hành: cân chắnh xác 10 g mẫu, sau ựó sấy ở 105oC ựến khối lượng không ựổị độ ẩm dầu ựược xác ựịnh theo công thức:
m1 Ờ m2
W = x 100 (%) m1
Trong ựó:
W : độ ẩm của dầu (%)
m1: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g) m2 : Khối lượng mẫu sau khi sấy (g)
3.2.1.2. định lượng Nitơ tổng số trong nguyên liệu [7]
Cách tiên hành: Cân mẫu nguyên liệu cho vào bình Kjeldhal, thêm vài giọt nước cất không chứa Nitơ ựể thấm ướt mẫu và 5ml H2SO4 ựậm ựặc. để yên bình trong tủ hút 30 phút hoặc qua ựêm.Sau ựó ựun nhẹ trong 30 phút, khi màu dung dịch từ ựen sàn nâu sẫm thì lấy bình ra ựể nguội, thêm 3 - 4 giọt HClO4 ựể xúc tác cho phản ứng vô cơ hóa diễn ra nhanh hơn. đun tiếp cho tới khi dung dịch chuyển sang màu nâu cánh gián ựến vàng nhạt rồi trắng trong.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31 Pha loãng dung dịch ựã vô cơ hóa: để nguội bình Kjeldhal, sau ựó chuyển dung dịch sang bình ựịnh mức 100 ml, thêm nước cất ựến vạch.
Cất NH3: Hút 20 ml dịch mẫu cho vào bình cất mẫu, cho thêm 2 - 3 giọt chỉ thị taxio, khi dung dịch chuyển sang màu tắm ựỏ thì cho thêm vào dung dịch NaOH 33 % ựến khi dung dịch chuyển sang màu vàng xanh thì dừng lạị đối với bình hứng mẫu, cho vào mỗi bình 25 ml axắt boric 2,5 % và 2-3 giọt chỉ thị tasirọ Tiến hành cất trên máy cất Microkjeldhal Công thức tắnh: ) 100 ( 100 142 , 0 ) ( W m v V b a NTS − ừ ừ ừ ừ ừ − = Trong ựó :
NTS: Hàm lượng Nitơ tổng số tắnh theo hàm lượng chất khô (%) a: Lượng H2SO4 0,01N ựược dùng ở bình thắ nghiệm (ml) b: Lượng H2SO4 0,01N ựược dùng ở bình ựối chứng (ml) V: Số ml dung dịch mẫu pha loãng
v: Số ml dung dịch mẫu ựem cất NH3 m: Khối lượng mẫu ựem phân tắch (gam) W: độ ẩm của nguyên liệu (%)
Chỉ số 0,142 là hệ số quy ựổi từ 1ml H2SO4 chuẩn ựộ ra số mg Nitơ trong mẫu
3.2.1.3 Xác ựịnh hàm lượng dầu trong nguyên liệu [7] Xác ựịnh hàm lượng dầu bằng phương pháp Shoxlet
Cách tiến hành: Cân 10g mẫu phân tắch ựã ựược nghiền nhỏ cho vào ống giấy lọc, gói kắn ống giấy lọc và có lót bông ở 2 ựầu, sau ựó cho vào ống trắch ly, lắp bình cầu ựã ựược sấy khô và cân khối lượng vào phắa dưới ống trắch ly, lắp ống sinh hàn và hệ thống ống nước vào phắa trên ống trắch lỵ Rót dung môi Petrolium Ether vào ống trắch ly, lượng dung môi bằng khoảng hai lần dung tắch ống. Dùng bếp ựiện gia nhiệt cho bình cầu khoảng 40 - 60 0C
Kiểm tra lượng dầu còn lại: Nhúng mẩu giấy lọc vào dung môi trong ống trắch ly, ựể khô giấy lọc, nếu không thấy dấu vết của dầu còn lại thì quá trình trắch ly có thể
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32 kết thúc, thường là 6 - 8 giờ.
Trắch ly xong tiến hành ựó sấy dầu ở 90 0C ựến khối lượng không ựổị Công thức tắnh hàm lượng dầu theo khối lượng nguyên liệu:
100 2 1− ừ = G G G X
Trong ựó: X: Hàm lượng dầu tắnh theo khối lượng nguyên liệu (%)
G1: Khối lượng bình và dầu sau khi sấy ựến khối lượng không ựổi (gam)
G2: Khối lượng bình (gam)
G: Khối lượng mẫu ựem trắch ly (gam)
3.2.1.4. Xác ựịnh chỉ số axắt bằng phương pháp chuẩn ựộ có sử dụng chỉ thị mầu Phenolphtalein[6]
Chỉ số axắt là chỉ số ựánh giá mức ựộ ôi hỏng của dầu mỡ, là số mg KOH 0,1N cần thiết ựể trung hoà các axắt béo tự do có trong 1g dầụ
Cách tiến hành: cân 3-5 g mẫu vào bình tam giác, thêm vào ựó 50 ml hỗn hợp dung môi n-hexan và benzen ựã ựược trung hoà, lắc cho tan mẫụ Sau ựó cho vào mỗi mẫu 5 giọt Phenolphtalein và chuẩn ựộ bằng dung dịch KOH 0,1 N ựến khi xuất hiện màu hồng nhạt, bền trong 30 giâỵ Chỉ số axắt ựược tắnh theo công thức:
AV = m V N ừ ừ 1 , 56
Trong ựó: Chỉ số 56,1: Khối lượng phân tử của KOH AV: Chỉ số axắt (mg KOH/g dầu)
N: Nồng ựộ ựương lượng gam của dung dịch KOH
V: Thể tắch dung dịch KOH ựã dùng khi chuẩn mẫu (ml) m: Khối lượng mẫu thử (g)
Hàm lượng axắt béo tự do (FFA) trong dầu ựược tắnh theo ựơn vị % :
FFA (%) = Trong ựó:
AV x M 10 x 56,1
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33 FFA : Hàm lượng axắt béo tự do có trong mẫu (%)
AV : Chỉ số axắt (mg KOH/g dầu)
M : Phân tử gam của axắt béo chủ yếu có trong dầu (g)
3.2.1.5. Xác ựịnh chỉ số peroxyt: Dùng phương pháp chuẩn ựộ lượng I2 thoát ra bằng
dung dịch Natrithiosulfat[5]
Chỉ số peroxyt ựặc trưng cho sự ôi hỏng của dầu mỡ, là số mili ựương lượng O2 có trong 1 kg dầụ
Cách tiến hành: Cân mẫu vào bình tam giác 250 ml ựã sấy khô trước. Cho vào bình chứa 25 ml dung môi peroxyt (chloroform/axắt axetic) và lắc cho hoà tan dầu vào dung môị Chuẩn bị dung dịch KI bão hoà bằng cách pha KI tinh thể vào nước cất theo tỷ lệ 10g KI/6 ml nước cất. Thêm vào bình chứa dung môi và mẫu 1 ml dung dịch KI bão hoà mới phạ đậy ngay nút lại và lắc ựều bình trong 1 phút. để bình chứa mẫu 5 phút trong bóng tối, sau ựó thêm 75 ml nước cất và chuẩn lượng iốt giải phóng ra bằng dung dịch natri thiosulfat với sự có mặt của hồ tinh bột. đồng thời tiến hành làm mẫu trắng trong những ựiều kiện tương tự.
Tắnh kết quả: PV = − 0 ừ10 P V V Trong ựó: PV: Chỉ số peroxyt (meqO2/kg)
V : Thể tắch natri thiosulfat 0,1 N ựã sử dụng cho mẫu phân tắch (ml)
V0: Thể tắch natri thiosulfat 0,1 N ựã sử dụng cho mẫu trắng (ml) P: Khối lượng mẫu phân tắch (g)
3.2.1.6. Xác ựịnh thành phần axắt béo theo phương pháp AOCS Cele- 91
ạ Chuẩn bị mẫu: Cân 1,0 g mẫu dầu hạt cải hoặc mẫu hỗn hợp axắt béo cho vào 100 ml hỗn hợp dung môi metanol và benzen. Tiến hành phản ứng methyl este hóa mẫu có mặt xúc tác H2SO4 ựậm ựặc ở nhiệt ựộ sôi (có lắp sinh hàn hồi lưu) trong thời gian 3 giờ. Sau ựó, ựuổi dung môi và trắch ly lại bằng 80ml n-hexan, rồi rửa dung dịch trong n-hexan bằng nước muối và nước cất cho ựến pH trung tắnh. Làm khan hỗn hợp bằng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 Na2SO4 sau ựó ựuổi dung môi ựể thu nhận hỗn hợp methyl este trên thiết bị cô quay chân không.
b. Cách xác ựịnh: Bơm 0,2 ộl hỗn hợp methyl este vừa thu ựược vào máy sắc ký khắ HP AGILENT 6890 ựể tiến hành xác ựịnh thành phần axắt béo trong mẫu, với các ựiều kiện như sau:
- Cột HP-INNOWax (PEG), 30m x 2,5mm x 2,5ộm - Khắ mang: Khắ hydrogen dùng cho sắc ký khắ - Tốc ựộ khắ mang H2: 50 cm/giây, áp suất 6 psi - Tỷ lệ chia dòng: 1/20
- Chương trình nhiệt: Nhiệt ựộ ựầu vào 500C/3 phút, sau ựó tăng ựến 2200C với tốc ựộ 80C/phút
- Detector: FID 2500C
Dựa vào chất chuẩn và sắc ký ựồ sẽ xác ựịnh ựược thành phần và hàm lượng của từng axắt béo có trong mẫu thắ nghiệm.
3.2.1.7. Xác ựịnh ựiểm nóng chảy bằng ống mao dẫn hở [7]
Xác ựịnh ựiểm nóng chảy của dầu hạt cải và sản phẩm hỗn hợp omega-3 và omega-6 ựược tiến hành như sau:
đun nóng chảy mẫu càng nhanh càng tốt ở nhiệt ựộ cao hơn nhiệt ựộ nóng chảy ắt nhất 50C nhưng không cao hơn 100C so với nhiệt ựộ nóng chảy hoàn toàn của mẫu thử, rồi loại ra các tạp chất và các vết bẩn còn sót lạị Nhúng ắt nhất 3 ống mao quản sạch vào mẫu ựã lỏng hoàn toàn cho mẫu dâng lên trong ống khoảng 10mm ổ 2mm. Ngay lập tức làm lạnh mẫu, áp sát phần cuối của ống mao quản chứa dầu vào một miếng ựá cho ựến khi mẫu hóa rắn. để các ống mao quản ựó trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ 4 - 10oC trong 16 giờ. Lấy mẫu ra khỏi tủ lạnh và gắn vào nhiệt kế (hay bằng phương tiện nào ựó thắch hợp) sao cho phần ống chứa mẫu ở vị trắ ựáy của bầu thủy ngân nhiệt kế. Treo nhiệt kế vào cốc thủy tinh 500ml có chứa nước cất sạch ựã làm lạnh xuống 0ồC. đáy của nhiệt kế phải nhúng chìm trong nước ựến vạch phải nhúng chìm sao cho các ống mao quản chứa mẫu phải chìm trong nước. điều chỉnh nhiệt ựộ bắt ựầu ựun thấp hơn ựiểm nóng chảy của mẫu từ 8 - 10oC, khuấy nước bằng một luồng hơi nhẹ bằng phương tiện thắch hợp khác. đun nóng cho tốc ựộ tăng nhiệt ựộ là 1oC/1phút và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35 giảm xuống 0,5oC/1phút khi gần ựến ựiểm nóng chảỵ Tiếp tục ựun nóng cho ựến khi cột chất lỏng dâng lên. đọc nhiệt ựộ tại thời ựiểm ựó. Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của các kết quả ựọc ựược.
3.2.1.8. Phương pháp ựịnh tắnh urê trong sản phẩm hỗn hợp omega-3 và omega-6
Phương pháp ựịnh tắnh urê dựa vào phản ứng tạo phức màu vàng chanh ựặc trưng giữa urê có trong mẫu phân tắch với thuốc thử p-dimethylaminobenzaldehyt.
Cách tiến hành: Cân 25 g mẫu hỗn hợp axắt béo omega-3 và omega-6 cho vào bình tam giác dung tắch 100 ml. Thêm 25 ml nước cất rồi khuấy ựều bằng ựũa thuỷ tinh. Sau ựó, ựậy kắn miệng bình lạị Đun từ từ bình tam giác trên bếp ựiện cho ựến sôị Chú ý, khi ựun phải lắc ựềụ Làm nguội mẫu rồi dùng giấy lọc Whatman 40 ựể lọc lấy dịch trong. Nhỏ 5 - 6 giọt dịch mẫu vào trong ống nghiệm chứa 5 ml dung dịch thuốc thử p-dimethylaminobenzaldehyt. Đun nóng dung dịch trong 1 phút. Quan sát màu